PTEN在纖維化肝組織中的動態(tài)表達(dá)及其對肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、肝纖維化（HF）是各種不同致病因子引起慢性肝病進(jìn)而發(fā)展為肝硬化的共有病理改變和必經(jīng)途徑，是肝臟對各種慢性損傷產(chǎn)生的一種修復(fù)反應(yīng)。其主要病理改變是細(xì)胞外間質(zhì)（ECM）的過度合成與異常沉積。肝星狀細(xì)胞（HSC）是參與該過程的最重要細(xì)胞，它的激活導(dǎo)致自身增殖和膠原合成增加被認(rèn)為是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，而肝纖維化恢復(fù)期HSC凋亡明顯增多。因此，抑制HSC活化、增殖或誘導(dǎo)其凋亡是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵所在。
　　 第10號染色體缺失的磷酸酶

2、張力蛋白同源物基因（PTEN）是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，可負(fù)性調(diào)控腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，其缺失或表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 近年來，對PTEN的研究已從腫瘤領(lǐng)域逐漸延伸至非腫瘤領(lǐng)域。研究表明，在特發(fā)性肺纖維化患者的肺組織中，成纖維細(xì)胞的PTEN表達(dá)及其磷酸酶活力都低于正常肺成纖維細(xì)胞；并且其過表達(dá)或激活可抑制體外肺成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡。在有關(guān)PTEN與

3、心肌纖維化的研究中也顯示PTEN基因敲除的小鼠心臟與體重之比增加、心肌纖維化程度明顯、心肌收縮性降低。這提示PTEN的低表達(dá)或失活參與了特發(fā)性肺纖維化及心肌纖維化的發(fā)生。而在PTEN與某些肝臟疾病的研究中，有研究發(fā)現(xiàn)特異性肝細(xì)胞PTEN缺失不僅可引起肝細(xì)胞癌而且還導(dǎo)致與肝纖維化密切相關(guān)的非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生。但迄今為止，PTEN在肝纖維化中的表達(dá)及作用，特別是對HSC增殖及凋亡的影響仍不清楚。為此，本研究應(yīng)用膽總管結(jié)扎法建立膽汁淤積

4、性大鼠肝纖維化模型，探討PTEN在肝纖維化過程中的動態(tài)表達(dá)及其與在體HSC增殖、凋亡的關(guān)系；并進(jìn)一步將攜帶野生型PTEN基因及其突變體G129E基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化HSC，觀察過表達(dá)的PTEN對活化HSC增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，同時探討PTEN調(diào)控活化HSC增殖、凋亡及細(xì)胞周期的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，旨在為深入揭示肝纖維化的病理生理機(jī)制，尋求有效預(yù)防和治療肝纖維的新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容主要包括以下四部分：
　　

5、第一部分 PTEN在大鼠纖維化肝組織中的動態(tài)表達(dá)及其與在體肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系
　　 目的：研究大鼠肝纖維化過程中肝組織的PTEN動態(tài)表達(dá)及其與在體HSC增殖、凋亡的關(guān)系。
　　 方法：膽總管結(jié)扎法建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型，HE、Masson三色染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色檢測大鼠肝組織中PTEN及α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的分布；免疫熒光雙標(biāo)記共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)測定大鼠肝組織中活

6、化HSC的PTEN表達(dá)；末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記（TUNEL）及α-SMA免疫組織化學(xué)雙染檢測在體活化HSC的凋亡；Western blot和Real-time Q-PCR檢測大鼠肝組織中PTEN蛋白及mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論：膽總管結(jié)扎法成功建立膽汁淤積性大鼠肝纖維化模型；大鼠肝纖維化形成過程中HSC的活化、增殖逐漸加快，而活化HSC的凋亡指數(shù)卻逐漸減少；隨著肝纖維化進(jìn)展，大鼠肝組織中PTEN蛋白

7、及mRNA表達(dá)逐漸下調(diào)，在體HSC的PTEN表達(dá)亦降低，其動態(tài)表達(dá)與在體HSC的活化、增殖呈顯著負(fù)相關(guān)，而與活化HSC凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)。
　　 第二部分 PTEN對體外活化肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　 目的：探討過表達(dá)的野生型PTEN及其突變體G129E（喪失了脂質(zhì)磷酸酶活性僅保留蛋白磷酸酶活性）對體外活化的HSC增殖、凋亡的影響及可能的機(jī)制。
　　 方法：利用AD293細(xì)胞擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所需的腺病毒（Ad-P

8、TEN、Ad-G129E、Ad-GFP），并測定滴度；以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的活化的HSC； Western blot及Real-time Q-PCR檢測HSC PTEN表達(dá)；MTT法檢測HSC增殖；TUNEL及碘化丙啶（PI）標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)測定HSC凋亡；Western blot檢測HSC的凋亡調(diào)控基因Bcl-2及Bax表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組如下：①Control組，僅以含8％胎牛血清的D

9、MEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染步驟入無血清無抗生素DMEM代替病毒液；②Ad-GFP組，轉(zhuǎn)染表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的空病毒Ad-GFP；③Ad-PTEN組，轉(zhuǎn)染攜帶野生型PTEN基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒Ad-PTEN；④Ad-G129E組，轉(zhuǎn)染攜帶PTEN的突變體G129E基因并表達(dá)GFP的重組腺病毒Ad-G129E。
　　 結(jié)論：外源性野生型PTEN基因及G129E基因成功轉(zhuǎn)染體外活化HSC；其過表達(dá)可明顯抑制活化H

10、SC增殖，誘導(dǎo)活化HSC凋亡，并引起HSC的凋亡調(diào)控基因Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)下降。而且野生型PTEN的作用明顯強(qiáng)于G129E。
　　 第三部分 PTEN對體外活化肝星狀細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)控作用
　　 目的：探討過表達(dá)的野生型PTEN及其突變體G129E對體外活化HSC細(xì)胞周期的調(diào)控作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)活化的HSC，以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時轉(zhuǎn)染體外活化的HSC；

11、流式細(xì)胞術(shù)測定HSC細(xì)胞周期時相；Western blot及Real-time Q-PCR檢測HSC的PTEN、細(xì)胞周期素D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期素依賴性激酶4（CDK4）及細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子（CDI）之一的P27kip1蛋白及mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組同第二部分。
　　 結(jié)論：過表達(dá)的野生型PTEN及G129E顯著抑制體外活化HSC細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)化，阻滯HSC細(xì)胞周期時相于G0/G1期；同時在轉(zhuǎn)錄和翻譯水

12、平上下調(diào)活化HSC的cyclinD1、CDK4表達(dá)，上調(diào)P27kip1表達(dá)，這可能是其阻滯活化HSC細(xì)胞周期進(jìn)程的重要機(jī)制。并且，在上述作用中野生型PTEN明顯強(qiáng)于G129E。
　　 第四部分 PTEN調(diào)控活化肝星狀細(xì)胞行為的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
　　 目的：探討PTEN調(diào)控活化肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)活化HSC，以腺病毒為載體將野生型PTEN基因及其突變體G129E基因瞬時轉(zhuǎn)

13、染體外活化HSC； Western blot檢測HSC的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶B（Akt）、p-Akt（Thr308）、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激1（ERK1）、p-ERK1蛋白表達(dá)；Real-time Q-PCR檢測Akt、ERK1 mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分組同第二部分。
　　 結(jié)論：PTEN通過其磷酸酶活性抑制Akt及ERK1的磷酸化；其負(fù)性調(diào)控活化HSC細(xì)胞周期、抑制活化HSC增殖及誘導(dǎo)活化HSC凋亡的作用與PI3K/Akt、ERk1/