PTEN在CCL4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化和自發(fā)逆轉(zhuǎn)肝組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其與在體肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系.pdf

1、肝纖維化(hepatic fibrosis， HF)是以膠原為主的細(xì)胞外間質(zhì)(extracellular matrix， ECM)成分在肝內(nèi)過(guò)多沉積所致。在肝臟受到慢性損傷時(shí)，纖維組織生成，如果不及時(shí)去除刺激因素，纖維組織則持續(xù)增生，從而形成肝硬化。肝纖維化是肝硬化發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)途徑，肝纖維化是可逆的，而肝硬化則難以逆轉(zhuǎn)。因此，研究肝纖維化的發(fā)病機(jī)制，從而阻斷甚或逆轉(zhuǎn)肝纖維化非常關(guān)鍵。
　　 肝星狀細(xì)胞(hepatic stel

2、late cells，HSC)是肝臟竇狀隙周?chē)?xì)胞，正常情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，炎癥、損傷等因素可以使其激活，產(chǎn)生大量以膠原為主的ECM成分和各種細(xì)胞因子。HSC是肝臟主要的纖維生成細(xì)胞，其活化、增殖可以啟動(dòng)整個(gè)肝纖維化過(guò)程，是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。HSC活化后難以恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)，肝臟主要通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制來(lái)去除活化HSC，而這恰是肝纖維化發(fā)生逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵所在。因此，抑制HSC活化、增殖，誘導(dǎo)活化的HSC凋亡對(duì)逆轉(zhuǎn)肝纖維化意義重大。
　　

3、 第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，其缺失或表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái)，對(duì)PTEN的研究已從腫瘤領(lǐng)域逐漸延伸至非腫瘤領(lǐng)域。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)在膽總管結(jié)扎(bile duct ligation， BDL)大鼠肝纖維化模型中，PTEN

4、與在體大鼠HSC活化、增殖呈負(fù)相關(guān)，與HSC凋亡呈正相關(guān)。而PTEN在肝纖維化逆轉(zhuǎn)中的表達(dá)改變尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在闡明PTEN在肝纖維化發(fā)病以及自發(fā)逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的表達(dá)改變，并探討其動(dòng)態(tài)表達(dá)與HSC增殖、凋亡的關(guān)系，從而為尋求有效預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肝纖維化的新策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：研究PTEN在大鼠肝纖維化及自發(fā)逆轉(zhuǎn)過(guò)程中的表達(dá)改變及其與在體HSC增殖、凋亡的關(guān)系。
　　 方法：使用成年健康雄性Wistar大鼠108只，

5、隨機(jī)分為模型組(30只）、模型對(duì)照組(30只)、逆轉(zhuǎn)組(24只)、逆轉(zhuǎn)對(duì)照組(24只)，進(jìn)行四肢輪流皮下注射40％CCl4橄欖油溶液（2ml·kg-1，2次/周）共5周建立大鼠肝纖維化模型，模型建立成功后停止應(yīng)用CCl4并正常飼養(yǎng)4周建立肝纖維化自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型，正常大鼠作為對(duì)照組，造模過(guò)程中大鼠無(wú)死亡。利用Haematoxylin and eosin staining（H&E染色）、Masson's trichrome staining（

6、MT染色）方法觀察肝臟病理學(xué)改變，免疫熒光方法檢測(cè)大鼠肝組織中PTEN及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)；采用免疫熒光雙標(biāo)記法利用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定在體活化HSC以及凋亡細(xì)胞中PTEN的表達(dá)改變；末段脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷缺口末段標(biāo)記(TUNEL)及α-SMA免疫熒光雙標(biāo)記方法檢測(cè)在體活化HSC的凋亡；Western blot和real-time fluore

7、scent quantitation PCR(real-time PCR)檢測(cè)PTEN蛋白及mRNA在大鼠肝組織中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：①H&E和MT染色結(jié)果顯示：CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型和自發(fā)逆轉(zhuǎn)模型成功建立，隨著CCl4用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，肝細(xì)胞變性壞死逐漸增多，大鼠肝纖維化程度逐漸加重；在停止注射后，隨著自發(fā)逆轉(zhuǎn)時(shí)間延長(zhǎng)，已形成的纖維組織逐漸減少，肝細(xì)胞逐漸恢復(fù)正常形態(tài)，再生肝細(xì)胞增多；②α-SMA免疫熒光染色顯示：對(duì)照

8、組正常大鼠肝組織中，α-SMA僅在血管壁平滑肌細(xì)胞有表達(dá)，造模1wk、2wk、3wk、4wk和5wk時(shí)大鼠肝組織內(nèi)α-SMA的累積陽(yáng)性光密度值(0.51±0.02，0.74±0.02，1.29±0.02，1.40±0.01，1.65±0.02)均顯著高于對(duì)照組(0.07±0.01)，P＜0.01;且各組之間均有顯著性差異(P＜0.01)；而在自發(fā)逆轉(zhuǎn)組，隨著自發(fā)逆轉(zhuǎn)時(shí)間的延長(zhǎng)，造模Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk和Re4 wk免

9、疫熒光結(jié)果顯示α-SMA陽(yáng)性表達(dá)(1.31±0.11，1.14±0.03，0.97±0.01，0.55±0.11)逐漸降低，但仍顯著高于對(duì)照組(0.12±0.04)，并且各組之間有顯著性差異，P＜0.01；③PTEN免疫熒光染色顯示：正常大鼠肝組織中PTEN蛋白廣泛表達(dá)于細(xì)胞漿，隨肝纖維化進(jìn)展，PTEN陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于纖維間隔、匯管區(qū)及增生的膽管周?chē)?xì)胞處。造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk大鼠肝組織內(nèi)PTEN蛋白的陽(yáng)性光密度

10、值逐漸降低(2.23±0.02，1.96±0.03，1.61±0.02，1.37±0.02，0.98±0.01)并顯著低于對(duì)照組(2.67±0.02)，P＜0.01;各組之間均有顯著性差異(P＜0.01)。在逆轉(zhuǎn)組，隨著停藥時(shí)間的延長(zhǎng)，PTEN蛋白表達(dá)逐漸回升(1.01±0.11，1.46±0.09，1.62±0.22，1.99±0.30)，由匯管區(qū)表達(dá)增加逐漸廣泛表達(dá)于肝小葉其它部位，但仍低于對(duì)照組(2.31±0.12)，各組之間具有

11、顯著性差異，P＜0.01;④Western blot分析顯示，造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk大鼠纖維化肝組織中PTEN蛋白表達(dá)量(1.33±0.10，1.12±0.13，0.83±0.10，0.55±0.08，0.41±0.09)，均顯著低于對(duì)照組(1.75±0.32)，P＜0.01;且各組之間比較也均有顯著性差異(P＜0.01），即大鼠肝纖維化越重PTEN蛋白表達(dá)越低。在逆轉(zhuǎn)組，造模Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk

12、及Re4 wk中PTEN蛋白表達(dá)量(0.10±0.03，0.21±0.05，0.36±0.08，0.44±0.06)，呈逐漸升高的趨勢(shì)，且各組之間具有顯著性差異(P＜0.01）；⑤應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用相對(duì)定量2-△△Ct法比較PTEN mRNA在各組大鼠肝組織中的表達(dá)，造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk肝組織中PTEN mRNA相對(duì)對(duì)照組的表達(dá)倍數(shù)為0.67±0.01，0.58±0.04，0.48±0.02，0.38±0

13、.04，0.28±0.08，均顯著低于對(duì)照組，并隨肝纖維化的加重而逐漸降低，P＜0.01。而在逆轉(zhuǎn)Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk及Re4 wk中，PTENmRNA的相對(duì)表達(dá)倍數(shù)分別為0.53±0.01，0.74±0.01，0.80±0.03，0.93±0.06，仍低于對(duì)照組，各組之間均有顯著性差異，P＜0.01;⑥PTEN和α-SMA在HSC的共表達(dá)產(chǎn)物，主要存在于活化HSC細(xì)胞漿，并且共表達(dá)區(qū)域以匯管區(qū)和纖維結(jié)締組織區(qū)域?yàn)橹?/p>

14、，共聚焦激光掃描顯微鏡圖像分析結(jié)果顯示，造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk大鼠肝組織中PTEN表達(dá)陽(yáng)性的活化HSC占總的活化HSC的比例分別為(0.90±0.05，0.75±0.03，0.41±0.03，0.29±0.02，0.23±0.03)。即隨著肝纖維化的進(jìn)展，活化HSC中PTEN表達(dá)逐漸降低。在逆轉(zhuǎn)Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk及Re4 wk組中，活化HSC中PTEN表達(dá)逐漸上升，并且具有顯著性差異(0.35±

15、0.02，0.57±0.02，0.66±0.02，0.71±0.02)(P＜0.01);⑦TUNEL及α-SMA免疫熒光雙重染色顯示：正常大鼠肝組織未見(jiàn)凋亡HSC，隨肝纖維化程度加重，活化HSC增多，凋亡HSC也隨之增多，造模1wk、2wk、3wk、4wk及5wk，大鼠肝組織活化HSC凋亡指數(shù)(7.12±0.03，6.35±0.02，4.11±0.02，3.68±0.02，1.50±0.03)顯著高于對(duì)照組，隨著肝纖維化病變加重，活化H

16、SC凋亡的比例逐漸減少(P＜0.01)。而停藥后，隨著肝纖維化的自發(fā)逆轉(zhuǎn)，活化HSC的凋亡指數(shù)顯著增加(1.20±0.23，1.35±0.12，4.20±0.17，6.51±0.45，P＜0.01)，凋亡的活化HSC主要集中在匯管區(qū)及纖維組織區(qū)域；⑧共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察TUNEL及PTEN免疫熒光雙重染色的大鼠肝組織冰凍切片，正常大鼠和模型1wk組大鼠肝組織未見(jiàn)凋亡細(xì)胞，隨肝纖維化程度加重，造模2wk、3wk、4wk及5wk可見(jiàn)凋

17、亡細(xì)胞逐漸增多，PTEN陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞比例逐漸降低(0.70±0.01，0.64±0.01，0.50±0.02，0.33±0.01)，P＜0.01。而在逆轉(zhuǎn)組，PTEN陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞和凋亡細(xì)胞進(jìn)一步增多，其比例在Re1 wk、Re2 wk、Re3 wk及Re4 wk中逐漸升高(0.78±0.02，0.80±0.01，0.92±0.02，0.95±0.02)；⑨對(duì)PTEN免疫熒光染色結(jié)果與α-SMA免疫熒光染色結(jié)果、PTEN陽(yáng)性的活化HS

18、C比例、活化HSC凋亡指數(shù)及PTEN陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞比例進(jìn)行Pearson's相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，大鼠纖維化肝組織中PTEN表達(dá)與α-SMA的表達(dá)呈顯著性負(fù)相關(guān)，與PTEN陽(yáng)性的活化HSC比例呈顯著性正相關(guān)，與活化HSC凋亡指數(shù)呈顯著性正相關(guān)，與PTEN陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞比例呈顯著正相關(guān)，r值分別為-0.979、0.962、0.991、0.979,P＜0.05。
　　 結(jié)論：CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化病變進(jìn)展中肝組織及其HSC的PT