肝纖維化相關(guān)細(xì)胞因子shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及在肝星狀細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的:結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是新近發(fā)現(xiàn)的一種促肝纖維化的重要細(xì)胞因子,是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforminggrowth factorβ,TGF-β)信號傳導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)介質(zhì)。CTGF可直接介導(dǎo)原代肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)活化、增殖及遷移,還能促進(jìn)活化HSC的合成及分泌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,

2、ECM)。金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase1,TIMP-1)也是TGF-β信號傳導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)介質(zhì),在肝纖維化發(fā)生時,它主要由激活的HSC表達(dá)。TIMP-1不僅抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)活性阻止膠原降解,也通過抑制HSC凋亡、促進(jìn)膠原分泌而在肝纖維化病情進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。所以,減少CTGF和TIMP-1的表達(dá),可

3、以減輕肝纖維化程度。本研究旨在構(gòu)建以大鼠CTGF或TIMP-1基因為靶點的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)表達(dá)載體,為進(jìn)一步探索肝纖維化的基因治療提供有力工具。方法:根據(jù)前期篩選出的對CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干擾靶位,即CTGF基因1560～1580nt和TIMP-1基因412～432nt,按照RNA干擾(RNA interference,RNAi)序列設(shè)計原則,各設(shè)計1對含有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的R

4、NAi靶點序列,退火形成雙鏈DNA,分別克隆到經(jīng)雙酶切后的質(zhì)粒載體psiRNA-DUO-GFPzeo,構(gòu)建成含目的靶基因片段的重組質(zhì)粒載體psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有CTGF和TIMP-1),并對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切瓊脂糖電泳和測序鑒定。體外復(fù)蘇培養(yǎng)大鼠的肝星狀細(xì)胞,取對數(shù)生長期細(xì)胞0.25％胰蛋白酶消化,3×105/ml接種于六孔板中,待細(xì)胞長到80％左右融合時,

5、無血清Opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)同步化,利用脂質(zhì)體(TransFast Transfmlection Reagent)2000介導(dǎo),將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒(psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有 CTGF和 TIMP-1)及空載體psiRNA—DUO-GFPzeo瞬時轉(zhuǎn)染大鼠的肝星狀細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染情況,用流式細(xì)胞儀測轉(zhuǎn)染的效率。結(jié)果:1、證實以大鼠CTGF或TI

6、MP-1基因為靶點的表達(dá) shRNA.的目的基因片段分別被成功的克隆到質(zhì)粒載體psiRNA—DUO-GFPzeo中,測序結(jié)果證明重組質(zhì)粒載體的插入序列與設(shè)計的靶基因片段完全一致。2:用瞬時轉(zhuǎn)染肝星狀細(xì)胞后熒光顯微鏡觀察,在轉(zhuǎn)染進(jìn)質(zhì)粒的細(xì)胞全部發(fā)綠色熒光,初步證實能轉(zhuǎn)染進(jìn)肝星狀細(xì)胞。結(jié)論:成功構(gòu)建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干擾靶位的shRNA表達(dá)質(zhì)粒重組體。瞬時轉(zhuǎn)染到轉(zhuǎn)染大鼠的肝星狀細(xì)胞,在熒光顯微鏡能發(fā)現(xiàn)帶有熒光的細(xì)胞