鈉泵α2亞基M4-M5區(qū)的克隆、表達(dá)及單抗的制備與鑒定.pdf

1、Na+,K+-ATPase,又稱(chēng)鈉泵,是高等真核生物細(xì)胞膜上普遍存在的一種特殊的膜結(jié)合蛋白,它在維持體內(nèi)滲透壓的平衡、穩(wěn)定細(xì)胞膜電位、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有重要作用。Na+,K+-ATPase是由α和β亞單位組成的異源二聚體,其中α亞單位是催化亞單位,它貫穿嵌入膜中,有10個(gè)跨膜區(qū)(M1～M10),具有酶的活性和許多鈉泵調(diào)節(jié)因子的結(jié)合位點(diǎn),其中M4～M5區(qū)直接參與了ATP的催化水解。鈉泵α亞基有α1、α2、α3、α4四種亞型,各異構(gòu)體間功能

2、各異,具有種屬特異性,近期的研究表明,鈉泵α2亞基與高血壓的發(fā)生和發(fā)展具有很大關(guān)系。本研究擬構(gòu)建鈉泵α2亞基M4～M5膜內(nèi)區(qū)蛋白BB4-5的原核表達(dá)體系,表達(dá)并純化目的蛋白,制備N(xiāo)a+-K+-ATPaseα2亞基的單克隆抗體,為進(jìn)一步研究鈉泵α2亞基在體內(nèi)的作用機(jī)制,及與疾病發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 一、鈉泵α2亞基M4-M5區(qū)蛋白的克隆和表達(dá)
　　 目的:利用基因重組技術(shù)構(gòu)建鈉泵α2亞基M4-M5膜內(nèi)區(qū)蛋白的表達(dá)載體

3、,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)獲得蛋白,通過(guò)蛋白純化技術(shù)將蛋白純化,為鈉泵α2亞基單抗制備提供抗原。
　　 方法:(1)鈉泵α2亞基M4-M5克隆載體的構(gòu)建。以質(zhì)粒YhNα2(含人鈉泵α2亞基cDNA序列)為模板,PCR擴(kuò)增得到α2亞基M4-M5區(qū)的基因片段BB4-5,將其加尾后連接至克隆載體pGM-T并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑選陽(yáng)性克隆,得到質(zhì)粒PGMT-BB4-5。(2)鈉泵α2亞基M4-M5蛋白表達(dá)體系的構(gòu)建。從質(zhì)粒PGMT-BB4-

4、5上切下目的基因片段,雙酶切連接到表達(dá)載體pET28b(+)上并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Rosetta2,挑選陽(yáng)性克隆,得到質(zhì)粒pET28b(+)-BB4-5。雙酶切驗(yàn)證目的基因序列是否正確。1％接種表達(dá)菌,用終濃度為0.4 mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。(3)重組蛋白的純化:將菌體破碎,SDS-PAGE電泳分析目的蛋白存在的形式,將包涵體變性和復(fù)性后,用Ni-NTA親和柱進(jìn)行純化,檢測(cè)目的蛋白的純度。(4)重組

5、蛋白的Western blotting分析:將Ni2+親和層析純化后的融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳后,電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,封閉,加入鈉泵α2亞基抗血清或抗His抗體,洗膜,DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色,凝膠成像儀照相。
　　 結(jié)果:(1)以質(zhì)粒YhNα2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到基因片段BB4-5,產(chǎn)物通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在相應(yīng)的位置出現(xiàn)明顯的條帶。將其加尾后連接至pGM-T載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α,挑選陽(yáng)性克隆

6、擴(kuò)增并提取質(zhì)粒,雙酶切和測(cè)序結(jié)果顯示基因序列與理論一致。(2)將目的基因片段與同樣雙酶切的PET28b(+)表達(dá)載體相連,轉(zhuǎn)化Rosetta2感受態(tài)細(xì)胞,在含Kan的平板上篩選重組子。雙酶切結(jié)果表明蛋白表達(dá)體系構(gòu)建成功。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE結(jié)果表明,BB4-5目的條帶與理論值一致。(3)菌體破碎后,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明,表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在,將包涵體用鹽酸胍變性,梯度稀釋復(fù)性后,用Ni-NTA親和柱進(jìn)

7、行純化,得到純度在90％以上的目的蛋白。(4)表達(dá)產(chǎn)物BB4-5經(jīng)Western blotting分析,可與鈉泵α2亞基的抗體及抗His抗體特異性結(jié)合.
　　 結(jié)論:本研究成功的構(gòu)建了鈉泵α2亞基M4-M5蛋白表達(dá)載體pET28b(+)-BB4-5,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),Ni-NTA親和柱進(jìn)行純化,得到純度在90％以上的目的蛋白,可作為抗原來(lái)制備鈉泵α2亞基單抗。
　　 二、鈉泵α2亞基單抗的制備與鑒定
　　 目的

8、:以鈉泵α2亞基M4-M5膜內(nèi)區(qū)重組蛋白為抗原,免疫BALB/c小鼠,通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體,并采用ELISA間接法和免疫印跡對(duì)單克隆抗體的特性進(jìn)行和鑒定,為探明鈉泵α2亞基在體內(nèi)的作用機(jī)制,及其與疾病發(fā)生的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:(1)將α2亞基純化蛋白作為抗原,免疫6～8周BALB/c小鼠。(2)通過(guò)雜交瘤技術(shù)來(lái)篩選α2亞基的單克隆抗體:取被免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞),與Sp2/O骨髓瘤細(xì)胞雜交;用間接ELIS

9、A法篩選陽(yáng)性(抗體分泌)細(xì)胞;將陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行克隆化,直接獲得可穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系,建株。(3)以小鼠腹水法制備雜交瘤的粗制單克隆抗體,采用辛酸-硫酸銨沉淀法將抗體進(jìn)行純化。(4)采用Sigma公司小鼠mAb Ig亞類(lèi)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體的亞型。(5)采用Western-blotting法檢測(cè)抗體的特異性。(6)參照Beatty的方法,采用間接ELISA法測(cè)定抗體的親和常數(shù)。
　　 結(jié)果:(1)6～8周B

10、ALB/c小鼠免疫后,測(cè)得小鼠血清抗體效價(jià)均為1:50000以上。(2)選取抗體效價(jià)較高的小鼠分離脾細(xì)胞,采用常規(guī)方法與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合,通過(guò)多次間接ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選,檢測(cè)出陽(yáng)性孔有14孔,克隆化后得到兩株效價(jià)較高細(xì)胞株。(3)小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)胞株,收集腹水,通過(guò)辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化,得到純化的mAb。(4)通過(guò)小鼠mAb Ig亞類(lèi)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)兩株mAb的亞型均為IgG2a。(5)Western-blott