副粘病毒天津株HN、M基因克隆與表達(dá)的研究.pdf

1、1999年6月，天津醫(yī)科大學(xué)微生物教研室從急性呼吸道感染致死的靈長類動物狨猴肺組織中分離出一株高血凝效價病毒，經(jīng)過一系列的研究證實(shí)為一株副粘病毒，即副粘病毒天津株。經(jīng)電鏡觀察具有典型的副粘病毒特征。用交叉血凝抑制試驗(yàn)對分離毒株進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增HN基因測序后，用生物信息學(xué)方法與多種核酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該毒株與仙臺病毒(SeV)特征最為接近<'1-3>。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該動物中心的工作人員都有此病毒的抗體，且在正常人群(獻(xiàn)血員)中抗體反應(yīng)也是

2、陽性，陽性率高達(dá)46％(14/40)，提示此病原體與人類有密切的關(guān)系，可能是一株人和絨猴共患的呼吸道病毒。我們現(xiàn)在已經(jīng)完成了對該株病毒的全基因組測序，通過全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，其與SeV同源性較高，也證明了該株病毒很可能為SeV一個新的基因型。 為進(jìn)一步研究該毒株的生物學(xué)特性及致病機(jī)制，本研究構(gòu)建了副粘病毒天津株包膜糖蛋白HN膜外區(qū)三個部分及整個M基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HN1、pET-28a-HN2、pET-28a

3、-HN3及 pMal-M，誘導(dǎo)表達(dá)、純化了重組蛋白HN1(aa61-aa260)、HN2(aa253-aa452)、HN3(aa376-aa575)和MBP-M，并對其生物學(xué)和免疫學(xué)活性進(jìn)行了初步研究。 我們提取病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)前期研究全基因組測序中的HN、M 的基因序列，設(shè)計并合成引物，以該株病毒的cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，雙酶切、純化回收含粘末端的目的片段和空質(zhì)粒，在T4 DNA連接酶作用下連接、轉(zhuǎn)化克隆菌

4、 E.coli TOP10。經(jīng)雙酶切、PCR 和基因測序鑒定篩選構(gòu)建正確的目的基因，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌 E.coli BL21，IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。pET-28a-HN1、pET-28a-HN2 和 pET-28a-HN3 所選用的載體質(zhì)粒帶有 6×His 標(biāo)簽，用Ni金屬螯合柱進(jìn)行回收，而pMal-M表達(dá)的蛋白帶有MBP融合蛋白，用Amylose resin回收得到純化的蛋白。用超速離心純化的病毒和純化表達(dá)蛋白分別制備 PcAb，利用 ELI

5、SA、Dot Blot及Westem Blot等方法對表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。通過血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)對副粘病毒天津株 HN1、HN2 和 HN3 蛋白的血凝功能及重組蛋白多克隆抗體的血凝抑制功能進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示：HN1、HN2和HN3 表現(xiàn)出來的天然抗原性明顯不同，抗原性強(qiáng)弱依次為HN2>HN3>HN1；M蛋白的ELISA和Dot Blot 方法鑒定結(jié)果也為陽性。而HN3的血凝活性明顯強(qiáng)于HN蛋白的其他部位，其次為HN2蛋白

6、，HN1幾乎沒有血凝功能。另外，利用ELISA方法對副粘病毒天津株HN1、HN2和HN3蛋白與甲型、乙型流感病毒的WHO 標(biāo)準(zhǔn)血清和天津 CDC 獲得的陽性血清的交叉免疫情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：HN1、HN2和HN3三種蛋白與這些血清存在交叉免疫反應(yīng)。 綜上，本研究成功的構(gòu)建了HN1、HN2、HN3和M的原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HN2、pET-28a-HN3及pMal-M，經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)、純化得到了重組蛋白 HN1、HN