副粘病毒天津株HN、M基因克隆與表達(dá)的研究.pdf

1、1999年6月，天津醫(yī)科大學(xué)微生物教研室從急性呼吸道感染致死的靈長(zhǎng)類動(dòng)物狨猴肺組織中分離出一株高血凝效價(jià)病毒，經(jīng)過(guò)一系列的研究證實(shí)為一株副粘病毒，即副粘病毒天津株。經(jīng)電鏡觀察具有典型的副粘病毒特征。用交叉血凝抑制試驗(yàn)對(duì)分離毒株進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增HN基因測(cè)序后，用生物信息學(xué)方法與多種核酸序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該毒株與仙臺(tái)病毒(SeV)特征最為接近<'1-3>。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該動(dòng)物中心的工作人員都有此病毒的抗體，且在正常人群(獻(xiàn)血員)中抗體反應(yīng)也是

2、陽(yáng)性，陽(yáng)性率高達(dá)46％(14/40)，提示此病原體與人類有密切的關(guān)系，可能是一株人和絨猴共患的呼吸道病毒。我們現(xiàn)在已經(jīng)完成了對(duì)該株病毒的全基因組測(cè)序，通過(guò)全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，其與SeV同源性較高，也證明了該株病毒很可能為SeV一個(gè)新的基因型。 為進(jìn)一步研究該毒株的生物學(xué)特性及致病機(jī)制，本研究構(gòu)建了副粘病毒天津株包膜糖蛋白HN膜外區(qū)三個(gè)部分及整個(gè)M基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HN1、pET-28a-HN2、pET-28a

3、-HN3及 pMal-M，誘導(dǎo)表達(dá)、純化了重組蛋白HN1(aa61-aa260)、HN2(aa253-aa452)、HN3(aa376-aa575)和MBP-M，并對(duì)其生物學(xué)和免疫學(xué)活性進(jìn)行了初步研究。 我們提取病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)前期研究全基因組測(cè)序中的HN、M 的基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物，以該株病毒的cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，雙酶切、純化回收含粘末端的目的片段和空質(zhì)粒，在T4 DNA連接酶作用下連接、轉(zhuǎn)化克隆菌

4、 E.coli TOP10。經(jīng)雙酶切、PCR 和基因測(cè)序鑒定篩選構(gòu)建正確的目的基因，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌 E.coli BL21，IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。pET-28a-HN1、pET-28a-HN2 和 pET-28a-HN3 所選用的載體質(zhì)粒帶有 6×His 標(biāo)簽，用Ni金屬螯合柱進(jìn)行回收，而pMal-M表達(dá)的蛋白帶有MBP融合蛋白，用Amylose resin回收得到純化的蛋白。用超速離心純化的病毒和純化表達(dá)蛋白分別制備 PcAb，利用 ELI

5、SA、Dot Blot及Westem Blot等方法對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行免疫學(xué)鑒定。通過(guò)血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)對(duì)副粘病毒天津株 HN1、HN2 和 HN3 蛋白的血凝功能及重組蛋白多克隆抗體的血凝抑制功能進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示：HN1、HN2和HN3 表現(xiàn)出來(lái)的天然抗原性明顯不同，抗原性強(qiáng)弱依次為HN2>HN3>HN1；M蛋白的ELISA和Dot Blot 方法鑒定結(jié)果也為陽(yáng)性。而HN3的血凝活性明顯強(qiáng)于HN蛋白的其他部位，其次為HN2蛋白

6、，HN1幾乎沒(méi)有血凝功能。另外，利用ELISA方法對(duì)副粘病毒天津株HN1、HN2和HN3蛋白與甲型、乙型流感病毒的WHO 標(biāo)準(zhǔn)血清和天津 CDC 獲得的陽(yáng)性血清的交叉免疫情況進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示：HN1、HN2和HN3三種蛋白與這些血清存在交叉免疫反應(yīng)。 綜上，本研究成功的構(gòu)建了HN1、HN2、HN3和M的原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-HN2、pET-28a-HN3及pMal-M，經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)、純化得到了重組蛋白 HN1、HN