孔壁表現(xiàn)納米化的nHA晶須增強多孔骨支架的制備與性能研究.pdf

1、在現(xiàn)代醫(yī)學中，由于創(chuàng)傷、感染、骨腫瘤切除和骨髓炎等原因導致的大段骨缺損是骨科臨床上常遇到的問題，而如何去修復骨缺損以恢復骨骼的完整和功能一直是困擾骨科醫(yī)生的難題。目前臨床上對于骨缺損的修復主要是通過自體骨(髂骨、肋骨)移植來完成的，但自體骨存在來源局限，且易造成神經及血管損傷，只能用于短節(jié)段骨缺損；通過同種異體骨移植來修復骨缺損是近幾年臨床常采用的方法，但異體骨移植存在免疫排斥等問題，易被自體骨排斥而造成骨不愈合，因此造成現(xiàn)代醫(yī)療技術對

2、治愈嚴重骨缺損方面還存在著來源少，不易愈合等問題。骨組織工程的發(fā)展為治愈骨缺損帶來了新的希望。通過對骨組織工程骨的不斷研究與開發(fā)，已經制備出具有高孔隙率、良好生物性能的人工骨，并且已經在骨科、頜面外科和口腔科上得到廣泛應用，取得了良好的經濟價值。隨著社會經濟的發(fā)展，對骨組織工程材料的需求也在不斷的增加。隨著技術的發(fā)展，骨組織工程支架材料在制備和材料上取得了巨大的進步，但現(xiàn)在臨床上應用的人工骨材料在骨誘導性，生物力學強度和骨解剖形態(tài)等方面

3、還存在不足，所以，制備出一種具有良好力學性能和生物活性，且具有與自然骨相似結構的人工骨支架材料，是當前骨組織工程研究的重中之重。
　　 近年來，高孔隙率磷酸鈣陶瓷的制備技術已經相當成熟，我們已經可以制備出孔隙率在97％以上的多孔支架，但是高孔隙率的提高導致支架強度降低，這一點制約了無機多孔骨支架移植材料的開發(fā)和應用。因此，如何解決孔隙率增高與強度下降之間的矛盾，制備出一種具有高孔隙率且能保持一定的力學強度，同時具有良好生物性能的

4、支架材料，是實現(xiàn)骨組織工程從實驗研究走向臨床應用必須要面對和解決的問題。
　　 對于骨組織工程支架材料，研究最多的是無機生物陶瓷材料，其中最有代表性的是羥基磷灰石和磷酸三鈣，它們與人體自然骨的無機成分相似，具有良好的骨傳導性和骨誘導性；但是陶瓷材料脆性較差，在制成多孔支架后無法達到所需要力學強度，因此，必須對陶瓷材料進行增強補韌的修飾，使之能達到承重骨缺損的力學要求。通過對生物陶瓷的研究，已經研究出一些陶瓷材料增強補韌的方法，主

5、要包括有纖維增強、晶須增強和顆粒增強等。
　　 所謂晶須其實也是纖維的一種類型，但它是以單晶形式生長，因此其直徑比一半纖維小，而且不含有晶界、位錯、空穴等缺陷。晶須的原子排列高度有序，使其機械強度達到鄰接原子間力。因此，由于晶須具有遠高于其他纖維的強度，所以常被作為增強體放入復合材料的制備過程中，用于制造出具有高強度的復合材料。其增強原理主要是靠橋接、裂紋偏轉和拔出等效應來吸收斷裂能量，從而消除材料尖端受到的集中應力，起到增強材

6、料力學性能的作用?？梢杂脕碇瞥删ы毜脑戏忠韵聨追N：陶瓷、金屬及高分子材料。通過在陶瓷原料中加入晶須材料可以顯著提高陶瓷的強度、韌性和彈性模量，對納米晶須生長的調控和生長機理有了初步的認知，并以用于實踐，但這些研究文獻中僅見于SiC/SiCw、SiCw/Si3N4、SiCw/AL2O3、莫來石等少數(shù)幾個工業(yè)用陶瓷體系，而對于晶須應用于生物陶瓷及多孔基質材料的增強作用研究甚少。
　　 隨著對骨生理和病理成骨機理研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)

7、自然骨是由nHA晶須和Ⅰ型膠原纖維組成的，所以，HA無機礦物質成分和結構與自然骨相類似，具有良好的生物相容性和骨誘導性，常被用來制備骨支架材料。但相對于塊狀HA來說，HA多孔支架的強度和韌性要比自然骨要低，目前只能用于非承重骨的骨缺損的修復上，所以，為提高陶瓷材料的強度和韌性，在本課題中我們通過將HA晶須作為增強材料加入到生物陶瓷材料中以期望能達到增強補韌的效果。
　　 綜上所述，本課題擬通過在陶瓷原料中實現(xiàn)納米羥基磷灰石晶須的

8、原位生長，并通過有機模板法經過一定燒結工藝制備出納米羥基磷灰石晶須增強多孔磷酸鈣支架，而后對其進行生物力學檢測和生物學檢測。隨后對人工骨支架孔壁表面進行納米化修飾，并與成骨細胞復合培養(yǎng)，研究孔壁表面納米化效應對成骨細胞粘附、生長、增殖的影響，并將人工骨支架移植到骨缺損模型中，以期望這種骨支架在保持高孔隙率的同時表現(xiàn)高強度，滿足不同部位對人工骨支架的強度要求，同時孔壁表面納米化修飾可以增加支架材料的生物性能和骨整合，起到骨缺損的填充和促進

9、成骨，加快骨重建的作用，為其最終能應用于臨床提供理論和實驗支持。
　　 實驗第一部分：nHAw/β-TCP復合多孔支架的制備與性能檢測
　　 目的：旨在通過實驗室合成原位納米羥基磷灰石晶須增強多孔磷酸鈣支架，并對其生物力學性能和生物安全性進行檢測。
　　 方法：通過水熱法合成原位納米羥基磷灰石晶須，并通過泡沫浸漿法制備出nHA晶須增強多孔磷酸鈣支架，掃描電鏡觀察分析支架材料表面形貌，XRD檢測其材料組成，液體位移

10、法測試骨支架孔隙率，萬能力學測試機測試材料力學強度，同時，按照ISO10993(GB/T16886)生物材料安全性檢測規(guī)定，對材料細胞毒性試驗、急性毒理試驗、過敏性和溶血試驗進行檢測。
　　 結果：我們成功合成了納米羥基磷灰石晶須，晶須長度在1～2μm左右，直徑在60～120nm左右，并且是晶須可以在1000℃下保持晶須形態(tài)。通過有機模板法，成功制備出納米nHA晶須增強多孔磷酸鈣支架，XRD檢測其主要成分是β-磷酸三鈣和羥基磷灰

11、石，孔隙率在72％至93％之間，強度在8.8～10.2MPa，通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)，羥基磷灰石晶須仍保持晶須形態(tài)，且均勻分布在支架孔壁中，起到增強補韌的作用。對支架的生物學特性觀察發(fā)現(xiàn)材料對細胞生長和增殖無不良影響，動物試驗急性毒性實驗陰性，溶血實驗陰性，且無致敏性。
　　 結論：通過水熱法與有機模板法等技術成功制備了原位納米羥基磷灰石晶須增強多孔磷酸鈣支架，納米羥基磷灰石晶須經過高溫燒結仍能保持晶須形態(tài)，起到強度增加的作用。經過

12、實驗證明，nHAw/β-TCP復合支架的生物相容性好，無急性毒性反應和體外溶血反應，是一種理想的人工骨支架。
　　 實驗第二部分：nHAw/β-TCP復合支架表面納米化修飾及孔壁表面納米效應對成骨細胞的影響
　　 目的：研究支架孔壁納米化對細胞生物學行為的調控作用機制，以及表面納米化的骨支架對成骨細胞的生長、增殖、蛋白分泌、鈣化和基因表達的影響，探索其對成骨細胞的效應機制。
　　 方法：通過化學沉積法對所制備的人

13、工骨支架進行表面納米化修飾，通過SEM對支架表面形貌進行觀察，隨后將MC3T3-E1細胞與支架復合培養(yǎng)，電鏡和免疫共聚焦對復合培養(yǎng)后的支架表面進行觀察，MTT法檢測復合培養(yǎng)1、4、7天后細胞增殖情況，ELSIA法檢測支架復合培養(yǎng)1、7、14天后ALP、COL-1、BSP蛋白表現(xiàn)，并對結果進行統(tǒng)計分析。
　　 結果：電鏡下觀察成骨細胞在表面納米圖案化的骨支架表面的生長情況時可以見到細胞在生長和分裂的時候在細胞的周圍長出很多細小的微

14、足，這些微足可以深入并附著在骨支架的納米圖案上。激光共聚焦觀察下可見隨著培養(yǎng)時間的增加，細胞的數(shù)量不斷增加，納米HA晶須增強及孔壁表面納米化多孔支架組與對照的β-TCP組相比較細胞數(shù)量明顯較多；MTT法檢測顯示隨著時間增加，兩種支架上吸光度值不斷增加，且納米羥基磷灰石晶須增強及表面納米化人工骨支架上MC3T3-E1細胞的吸光度值在同一時間點上明顯高于普通對照組的磷酸鈣骨支架，統(tǒng)計學結果顯示與對照組比較有顯著性差異。ELSLA檢測顯示隨著

15、培養(yǎng)時間的增加，三種蛋白在支架上的表達量不斷增加，且在相同時間點上兩種支架蛋白表達量經統(tǒng)計分析(P<0.01)，有統(tǒng)計學差異。
　　 結論：孔壁表面納米化修飾后的支架表面具有納米級顆粒和溝紋，材料具有納米顆粒的性質，可以增加細胞的粘附性和促進細胞生長、增殖和分泌功能。
　　 實驗第三部分：nHAw/β-TCP復合支架對兔椎體和羊脛骨缺損修復的實驗研究
　　 目的：評價孔壁表面納米化nHAw/β-TCP復合支架對兔

16、椎體缺損和羊脛骨缺損的修復性能。
　　 方法：建立兔L5-6橫突間骨缺損的實驗動物模型和羊脛骨骨缺損模型，將制備的人工骨支架材料植入缺損部位，對照組使用單純β-TCP材料。術后12周處死動物取材，通過大體觀察、X線觀察、電鏡觀察及組織學來評價支架材料成骨修復情況。
　　 結果：大體觀察nHAw/β-TCP復合支架充填的骨缺損處有大量骨痂形成，缺損修復處較牢固，與單純β-TCP相比，支架與自然骨之間接觸要好，缺損處骨修復效