孔壁表現(xiàn)納米化的nHA晶須增強(qiáng)多孔骨支架的制備與性能研究.pdf

1、在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，由于創(chuàng)傷、感染、骨腫瘤切除和骨髓炎等原因?qū)е碌拇蠖喂侨睋p是骨科臨床上常遇到的問題，而如何去修復(fù)骨缺損以恢復(fù)骨骼的完整和功能一直是困擾骨科醫(yī)生的難題。目前臨床上對(duì)于骨缺損的修復(fù)主要是通過自體骨(髂骨、肋骨)移植來完成的，但自體骨存在來源局限，且易造成神經(jīng)及血管損傷，只能用于短節(jié)段骨缺損；通過同種異體骨移植來修復(fù)骨缺損是近幾年臨床常采用的方法，但異體骨移植存在免疫排斥等問題，易被自體骨排斥而造成骨不愈合，因此造成現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)對(duì)

2、治愈嚴(yán)重骨缺損方面還存在著來源少，不易愈合等問題。骨組織工程的發(fā)展為治愈骨缺損帶來了新的希望。通過對(duì)骨組織工程骨的不斷研究與開發(fā)，已經(jīng)制備出具有高孔隙率、良好生物性能的人工骨，并且已經(jīng)在骨科、頜面外科和口腔科上得到廣泛應(yīng)用，取得了良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，對(duì)骨組織工程材料的需求也在不斷的增加。隨著技術(shù)的發(fā)展，骨組織工程支架材料在制備和材料上取得了巨大的進(jìn)步，但現(xiàn)在臨床上應(yīng)用的人工骨材料在骨誘導(dǎo)性，生物力學(xué)強(qiáng)度和骨解剖形態(tài)等方面

3、還存在不足，所以，制備出一種具有良好力學(xué)性能和生物活性，且具有與自然骨相似結(jié)構(gòu)的人工骨支架材料，是當(dāng)前骨組織工程研究的重中之重。
　　 近年來，高孔隙率磷酸鈣陶瓷的制備技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，我們已經(jīng)可以制備出孔隙率在97％以上的多孔支架，但是高孔隙率的提高導(dǎo)致支架強(qiáng)度降低，這一點(diǎn)制約了無機(jī)多孔骨支架移植材料的開發(fā)和應(yīng)用。因此，如何解決孔隙率增高與強(qiáng)度下降之間的矛盾，制備出一種具有高孔隙率且能保持一定的力學(xué)強(qiáng)度，同時(shí)具有良好生物性能的

4、支架材料，是實(shí)現(xiàn)骨組織工程從實(shí)驗(yàn)研究走向臨床應(yīng)用必須要面對(duì)和解決的問題。
　　 對(duì)于骨組織工程支架材料，研究最多的是無機(jī)生物陶瓷材料，其中最有代表性的是羥基磷灰石和磷酸三鈣，它們與人體自然骨的無機(jī)成分相似，具有良好的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性；但是陶瓷材料脆性較差，在制成多孔支架后無法達(dá)到所需要力學(xué)強(qiáng)度，因此，必須對(duì)陶瓷材料進(jìn)行增強(qiáng)補(bǔ)韌的修飾，使之能達(dá)到承重骨缺損的力學(xué)要求。通過對(duì)生物陶瓷的研究，已經(jīng)研究出一些陶瓷材料增強(qiáng)補(bǔ)韌的方法，主

5、要包括有纖維增強(qiáng)、晶須增強(qiáng)和顆粒增強(qiáng)等。
　　 所謂晶須其實(shí)也是纖維的一種類型，但它是以單晶形式生長(zhǎng)，因此其直徑比一半纖維小，而且不含有晶界、位錯(cuò)、空穴等缺陷。晶須的原子排列高度有序，使其機(jī)械強(qiáng)度達(dá)到鄰接原子間力。因此，由于晶須具有遠(yuǎn)高于其他纖維的強(qiáng)度，所以常被作為增強(qiáng)體放入復(fù)合材料的制備過程中，用于制造出具有高強(qiáng)度的復(fù)合材料。其增強(qiáng)原理主要是靠橋接、裂紋偏轉(zhuǎn)和拔出等效應(yīng)來吸收斷裂能量，從而消除材料尖端受到的集中應(yīng)力，起到增強(qiáng)材

6、料力學(xué)性能的作用?？梢杂脕碇瞥删ы毜脑戏忠韵聨追N：陶瓷、金屬及高分子材料。通過在陶瓷原料中加入晶須材料可以顯著提高陶瓷的強(qiáng)度、韌性和彈性模量，對(duì)納米晶須生長(zhǎng)的調(diào)控和生長(zhǎng)機(jī)理有了初步的認(rèn)知，并以用于實(shí)踐，但這些研究文獻(xiàn)中僅見于SiC/SiCw、SiCw/Si3N4、SiCw/AL2O3、莫來石等少數(shù)幾個(gè)工業(yè)用陶瓷體系，而對(duì)于晶須應(yīng)用于生物陶瓷及多孔基質(zhì)材料的增強(qiáng)作用研究甚少。
　　 隨著對(duì)骨生理和病理成骨機(jī)理研究的深入，我們發(fā)現(xiàn)

7、自然骨是由nHA晶須和Ⅰ型膠原纖維組成的，所以，HA無機(jī)礦物質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)與自然骨相類似，具有良好的生物相容性和骨誘導(dǎo)性，常被用來制備骨支架材料。但相對(duì)于塊狀HA來說，HA多孔支架的強(qiáng)度和韌性要比自然骨要低，目前只能用于非承重骨的骨缺損的修復(fù)上，所以，為提高陶瓷材料的強(qiáng)度和韌性，在本課題中我們通過將HA晶須作為增強(qiáng)材料加入到生物陶瓷材料中以期望能達(dá)到增強(qiáng)補(bǔ)韌的效果。
　　 綜上所述，本課題擬通過在陶瓷原料中實(shí)現(xiàn)納米羥基磷灰石晶須的

8、原位生長(zhǎng)，并通過有機(jī)模板法經(jīng)過一定燒結(jié)工藝制備出納米羥基磷灰石晶須增強(qiáng)多孔磷酸鈣支架，而后對(duì)其進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)和生物學(xué)檢測(cè)。隨后對(duì)人工骨支架孔壁表面進(jìn)行納米化修飾，并與成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，研究孔壁表面納米化效應(yīng)對(duì)成骨細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)、增殖的影響，并將人工骨支架移植到骨缺損模型中，以期望這種骨支架在保持高孔隙率的同時(shí)表現(xiàn)高強(qiáng)度，滿足不同部位對(duì)人工骨支架的強(qiáng)度要求，同時(shí)孔壁表面納米化修飾可以增加支架材料的生物性能和骨整合，起到骨缺損的填充和促進(jìn)

9、成骨，加快骨重建的作用，為其最終能應(yīng)用于臨床提供理論和實(shí)驗(yàn)支持。
　　 實(shí)驗(yàn)第一部分：nHAw/β-TCP復(fù)合多孔支架的制備與性能檢測(cè)
　　 目的：旨在通過實(shí)驗(yàn)室合成原位納米羥基磷灰石晶須增強(qiáng)多孔磷酸鈣支架，并對(duì)其生物力學(xué)性能和生物安全性進(jìn)行檢測(cè)。
　　 方法：通過水熱法合成原位納米羥基磷灰石晶須，并通過泡沫浸漿法制備出nHA晶須增強(qiáng)多孔磷酸鈣支架，掃描電鏡觀察分析支架材料表面形貌，XRD檢測(cè)其材料組成，液體位移

10、法測(cè)試骨支架孔隙率，萬能力學(xué)測(cè)試機(jī)測(cè)試材料力學(xué)強(qiáng)度，同時(shí)，按照ISO10993(GB/T16886)生物材料安全性檢測(cè)規(guī)定，對(duì)材料細(xì)胞毒性試驗(yàn)、急性毒理試驗(yàn)、過敏性和溶血試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果：我們成功合成了納米羥基磷灰石晶須，晶須長(zhǎng)度在1～2μm左右，直徑在60～120nm左右，并且是晶須可以在1000℃下保持晶須形態(tài)。通過有機(jī)模板法，成功制備出納米nHA晶須增強(qiáng)多孔磷酸鈣支架，XRD檢測(cè)其主要成分是β-磷酸三鈣和羥基磷灰

11、石，孔隙率在72％至93％之間，強(qiáng)度在8.8～10.2MPa，通過SEM觀察發(fā)現(xiàn)，羥基磷灰石晶須仍保持晶須形態(tài)，且均勻分布在支架孔壁中，起到增強(qiáng)補(bǔ)韌的作用。對(duì)支架的生物學(xué)特性觀察發(fā)現(xiàn)材料對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖無不良影響，動(dòng)物試驗(yàn)急性毒性實(shí)驗(yàn)陰性，溶血實(shí)驗(yàn)陰性，且無致敏性。
　　 結(jié)論：通過水熱法與有機(jī)模板法等技術(shù)成功制備了原位納米羥基磷灰石晶須增強(qiáng)多孔磷酸鈣支架，納米羥基磷灰石晶須經(jīng)過高溫?zé)Y(jié)仍能保持晶須形態(tài)，起到強(qiáng)度增加的作用。經(jīng)過

12、實(shí)驗(yàn)證明，nHAw/β-TCP復(fù)合支架的生物相容性好，無急性毒性反應(yīng)和體外溶血反應(yīng)，是一種理想的人工骨支架。
　　 實(shí)驗(yàn)第二部分：nHAw/β-TCP復(fù)合支架表面納米化修飾及孔壁表面納米效應(yīng)對(duì)成骨細(xì)胞的影響
　　 目的：研究支架孔壁納米化對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用機(jī)制，以及表面納米化的骨支架對(duì)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、蛋白分泌、鈣化和基因表達(dá)的影響，探索其對(duì)成骨細(xì)胞的效應(yīng)機(jī)制。
　　 方法：通過化學(xué)沉積法對(duì)所制備的人

13、工骨支架進(jìn)行表面納米化修飾，通過SEM對(duì)支架表面形貌進(jìn)行觀察，隨后將MC3T3-E1細(xì)胞與支架復(fù)合培養(yǎng)，電鏡和免疫共聚焦對(duì)復(fù)合培養(yǎng)后的支架表面進(jìn)行觀察，MTT法檢測(cè)復(fù)合培養(yǎng)1、4、7天后細(xì)胞增殖情況，ELSIA法檢測(cè)支架復(fù)合培養(yǎng)1、7、14天后ALP、COL-1、BSP蛋白表現(xiàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：電鏡下觀察成骨細(xì)胞在表面納米圖案化的骨支架表面的生長(zhǎng)情況時(shí)可以見到細(xì)胞在生長(zhǎng)和分裂的時(shí)候在細(xì)胞的周圍長(zhǎng)出很多細(xì)小的微

14、足，這些微足可以深入并附著在骨支架的納米圖案上。激光共聚焦觀察下可見隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞的數(shù)量不斷增加，納米HA晶須增強(qiáng)及孔壁表面納米化多孔支架組與對(duì)照的β-TCP組相比較細(xì)胞數(shù)量明顯較多；MTT法檢測(cè)顯示隨著時(shí)間增加，兩種支架上吸光度值不斷增加，且納米羥基磷灰石晶須增強(qiáng)及表面納米化人工骨支架上MC3T3-E1細(xì)胞的吸光度值在同一時(shí)間點(diǎn)上明顯高于普通對(duì)照組的磷酸鈣骨支架，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示與對(duì)照組比較有顯著性差異。ELSLA檢測(cè)顯示隨著

15、培養(yǎng)時(shí)間的增加，三種蛋白在支架上的表達(dá)量不斷增加，且在相同時(shí)間點(diǎn)上兩種支架蛋白表達(dá)量經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析(P<0.01)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：孔壁表面納米化修飾后的支架表面具有納米級(jí)顆粒和溝紋，材料具有納米顆粒的性質(zhì)，可以增加細(xì)胞的粘附性和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分泌功能。
　　 實(shí)驗(yàn)第三部分：nHAw/β-TCP復(fù)合支架對(duì)兔椎體和羊脛骨缺損修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：評(píng)價(jià)孔壁表面納米化nHAw/β-TCP復(fù)合支架對(duì)兔

16、椎體缺損和羊脛骨缺損的修復(fù)性能。
　　 方法：建立兔L5-6橫突間骨缺損的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型和羊脛骨骨缺損模型，將制備的人工骨支架材料植入缺損部位，對(duì)照組使用單純?chǔ)?TCP材料。術(shù)后12周處死動(dòng)物取材，通過大體觀察、X線觀察、電鏡觀察及組織學(xué)來評(píng)價(jià)支架材料成骨修復(fù)情況。
　　 結(jié)果：大體觀察nHAw/β-TCP復(fù)合支架充填的骨缺損處有大量骨痂形成，缺損修復(fù)處較牢固，與單純?chǔ)?TCP相比，支架與自然骨之間接觸要好，缺損處骨修復(fù)效