人肝癌細胞系轉(zhuǎn)移相關酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的差異研究.pdf

1、本研究通過對不轉(zhuǎn)移人肝癌細胞系(Hep3B)與具有低、高轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細胞系(MHCC97L/MHCC97H)的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達譜差異分析，找到與HCC轉(zhuǎn)移復發(fā)相關的關鍵酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)分子。利用三種不同方法從不同角度篩出一些差異蛋白質(zhì)，并對其中的膜聯(lián)蛋白I進行了再驗證?！　〉谝徊糠秩烁伟┘毎抵修D(zhuǎn)移相關酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)的差異分析。優(yōu)化雙向凝膠電泳，蛋白印跡及酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)富集相關技術(shù)，建立相對穩(wěn)定、適合本實驗室的技術(shù)

2、平臺，聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，篩查在肝癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用的差異酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)分子。采用三種不同的方法，從不同角度和層面對三種具有不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細胞系中酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達譜進行檢測分析：(1)用2-DE+蛋白印跡+MALDI-TOF-MS/MS。(2)用免疫沉淀(差異條帶)+MALDI-TOF-MS/MS。(3)用免疫沉淀(全酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì))+LC-ESI-MS/MS?！　〉诙糠洲D(zhuǎn)移潛能不同人肝癌細胞系中差異酪氨酸磷酸化

3、蛋白質(zhì)的再驗證。為保證差異酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)篩選結(jié)果的可信度及下游分析的確定性，我們選取差異蛋白質(zhì)中的膜聯(lián)蛋白Ⅰ進行了再驗證，應用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、蛋白印跡和細胞免疫化學技術(shù)證實膜聯(lián)蛋白Ⅰ的確在有轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細胞系中高表達。結(jié)論：1.通過對2-DE、酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)富集技術(shù)的摸索和優(yōu)化，聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)建立了適合篩查磷酸化蛋白質(zhì)的技術(shù)平臺。2.建立了不轉(zhuǎn)移人肝癌細胞系Hep3B的酪氨酸磷酸化蛋白質(zhì)表達譜。3.與