馬尾松(Pinusmassoniana)內(nèi)生真菌篩選培養(yǎng)及其在產(chǎn)油脂中的應(yīng)用.pdf

1、植物內(nèi)生真菌泛指那些在其整個(gè)生活史或生活史中的某一階段生活在植物組織內(nèi)部，對(duì)植物組織不引起明顯病害癥狀的一類真菌。植物內(nèi)生真菌在各種植物中都普遍存在，分布在根、莖、葉等器官表皮下的組織中。植物內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)生存，與宿主植物在長期演化中互惠互利，共同生長。前人對(duì)內(nèi)生真菌的生物學(xué)作用和內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物做了很多相關(guān)研究。研究表明，植物內(nèi)生真菌對(duì)宿主植物的生長有促進(jìn)作用，能增強(qiáng)宿主植物對(duì)病蟲害的抵抗能力，提高宿主植物對(duì)生物脅迫和非生物

2、脅迫的抗性，在植物體內(nèi)能產(chǎn)生多種具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。同時(shí)，宿主植物與其內(nèi)生真菌長期共生，相互影響，大多數(shù)植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與其宿主相同或相似的活性成分。馬尾松栽植面積廣，是我國松屬（Pinus）樹種中重要的用材樹種，也是荒山造林的先鋒樹種。馬尾松富含松脂，是中國主要產(chǎn)脂樹種。關(guān)于馬尾松內(nèi)生真菌在產(chǎn)油脂中的應(yīng)用研究未見報(bào)道。
　　以馬尾松為研究對(duì)象，進(jìn)行馬尾松內(nèi)生真菌的分離和鑒定，并作多樣性分析，運(yùn)用馬尾松內(nèi)生真菌液體發(fā)酵

3、液進(jìn)行微生物采脂研究、進(jìn)行馬尾松內(nèi)生真菌對(duì)松脂產(chǎn)量影響的回歸分析、馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂效果研究及內(nèi)生真菌分子生物學(xué)鑒定。為馬尾松的綜合開發(fā)利用，進(jìn)一步形成生產(chǎn)力提供技術(shù)依據(jù)。
　　主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、馬尾松各器官的樣品采自福建省漳平五一國有林場(chǎng)。經(jīng)表面消毒，從馬尾松根、莖、葉中分離得到102株內(nèi)生真菌。經(jīng)顯微形態(tài)觀察，歸屬為11個(gè)屬，分屬于6科6目4綱3門。表明馬尾松的內(nèi)生真菌種類具有豐富的多樣性。分離鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)

4、，內(nèi)生真菌分布在馬尾松的不同器官組織的菌株數(shù)量和種群上都存在較大差異，從葉器官分離到的內(nèi)生真菌株數(shù)和涉及屬的數(shù)量最多，莖部次之，根部最少。毛霉屬（Mucor）、木霉屬（Trichoderma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）在根、莖、葉器官中都有分布，其它屬只分布在根、莖、葉中的某兩個(gè)器官組織中。曲霉屬（Aspergillus）、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）和青霉屬（Pen

5、icillium）是馬尾松內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢(shì)屬。其余屬（鐮刀菌屬（Fusarium）、擬青霉屬（Paecilomyces）、生赤殼屬（Bionectria）、葉點(diǎn)霉屬（Phyllosticta）和叢梗孢屬（Monilia））菌株數(shù)相對(duì)較少，為非優(yōu)勢(shì)屬。
　　2、首次應(yīng)用馬尾松內(nèi)生真菌進(jìn)行微生物采脂研究。從馬尾松根、莖、葉分離出的內(nèi)生真菌中選取十株優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行試驗(yàn)。研究區(qū)位于福建省龍巖市新羅區(qū)小池鎮(zhèn)卓洋村。將10株馬尾松內(nèi)生真菌發(fā)酵液

6、及其組成的混合發(fā)酵液替代化學(xué)刺激劑分別涂刷于割溝進(jìn)行微生物采脂。通過試驗(yàn)，涂菌后的馬尾松平均單株單刀產(chǎn)脂量均高于涂菌前平均單株單刀產(chǎn)脂量，而混合發(fā)酵液形成的松脂增產(chǎn)率最高，為40.83％。
　　從該試驗(yàn)的10株馬尾松內(nèi)生真菌中選取形成松脂增產(chǎn)率前3位的菌ZI41155、BS4787、FH0131進(jìn)行試驗(yàn)，研究不同菌種、不同胸徑和不同侵染次數(shù)對(duì)馬尾松松脂產(chǎn)量的影響。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以菌種、胸徑和侵染次數(shù)為試驗(yàn)因素，各因素取3個(gè)

7、水平，進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌種、胸徑和侵染次數(shù)3種因素對(duì)松脂產(chǎn)量影響程度的大小有較大的差異。胸徑對(duì)松脂產(chǎn)量的影響程度最大，菌種次之，侵染次數(shù)對(duì)松脂產(chǎn)量的影響最小。在顯著水平α=0.01上，菌種對(duì)松脂增產(chǎn)率的影響極顯著。在顯著水平α=0.05上，侵染次數(shù)對(duì)松脂增產(chǎn)率的影響不顯著。菌ZI41155形成的松脂增產(chǎn)率均值最高，菌BS4787的次之，菌FH0131形成的松脂增產(chǎn)率均值最低。三個(gè)徑階中，松脂增產(chǎn)率均值隨胸徑的增大

8、而增大。三種侵染次數(shù)形成的松脂增產(chǎn)率均值隨侵染次數(shù)的增多而增大。
　　3、選取第二部分正交試驗(yàn)得出的菌種因素中最優(yōu)水平菌ZI41155進(jìn)行試驗(yàn)。以胸徑為自變量，松脂增產(chǎn)率為因變量，研究用菌ZI41155發(fā)酵液進(jìn)行微生物采脂時(shí)，形成的松脂增產(chǎn)率與胸徑的關(guān)系。隨機(jī)選取100株胸徑在18cm以上的馬尾松，將菌ZI41155的發(fā)酵液涂刷于馬尾松樹體割溝，進(jìn)行微生物采脂試驗(yàn)。根據(jù)最小二乘法的建模原理和方法，利用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)胸徑及松

9、脂增產(chǎn)率進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程：Y=-28.608+2.76X。經(jīng)方差分析及對(duì)回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果均表明，所建立的回歸方程顯著，表明所建立的回歸方程有效。
　　4、首次進(jìn)行馬尾松內(nèi)生真菌產(chǎn)油脂效果的研究。從第二部分試驗(yàn)的10株馬尾松內(nèi)生真菌中選取形成松脂增產(chǎn)率前4位的菌ZI41155、BS4787、FH0131、BS18200進(jìn)行試驗(yàn)。用蘇丹黑染液對(duì)菌絲染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)四株內(nèi)生真菌菌絲中均有油滴存在。應(yīng)用酸熱

10、法提取油脂，測(cè)定油脂含量，并采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析油脂組分。結(jié)果表明：4株馬尾松內(nèi)生真菌油脂含量均達(dá)20%以上，最高含量達(dá)30.56%。4菌株都含有脂肪酸，且均占油脂提取物的64%以上，不飽和脂肪酸含量均達(dá)46％以上。油脂組分主要為棕櫚酸酯、硬脂酸、油酸、亞油酸、反油酸等，其中油酸含量最大，達(dá)42.08%。
　　5、對(duì)第四部分試驗(yàn)的4株馬尾松產(chǎn)油脂內(nèi)生真菌ZI41155、BS4787、FH0131、BS182

11、00進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。對(duì)4株馬尾松內(nèi)生菌產(chǎn)油脂菌株進(jìn)行基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增、序列測(cè)定。將測(cè)序得到的基因序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行Blast分析，利用ClustalX2.1軟件對(duì)多個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)分析，應(yīng)用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建分析，進(jìn)行親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析。通過比對(duì)分析，結(jié)合其菌落形態(tài)特征，初步鑒定菌ZI41155為擬青霉屬（Paecilomyces）、菌BS4787為生赤殼菌屬（Bionectri