人類免疫缺陷病毒診斷抗體的親和力成熟.pdf

1、9E8是本實驗室篩選獲得的一株針對人類免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus,HIV)的鼠源抗體,其親和力為3.23×10-10M,目前已經(jīng)成功應(yīng)用到本實驗室開發(fā)的HIV診斷試劑盒中,但其靈敏度和特異性都還有待提高。
　　 本研究的目的就是利用噬菌體展示技術(shù)對HIV診斷抗體9E8進行親和力成熟,進一步提高HIV診斷的靈敏度和特異性。首先,用RT-PCR的方法從雜交瘤細(xì)胞中調(diào)取鼠源抗體9E8的可變區(qū)基

2、因,將其構(gòu)建成單鏈抗體VH-(G4S)3-VL的形式,展示到噬菌體pⅢ蛋白上,并驗證ScFv的活性。確定噬菌體ScFv具有結(jié)合活性后,用CDR替換的方法,確定抗體抗原結(jié)合的關(guān)鍵CDR區(qū)。將9E8-ScFv的VH和VL氨基酸序列分別輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中,按照骨架區(qū)同源度最高而CDR氨基酸序列差異最大的原則,搜尋人源抗體的CDR序列作為CDR替換序列,每個9E8-ScFv中的CDR對應(yīng)2種替換序列。CDR替換后,用Elisa方法檢測活性,

3、最終確定了三個關(guān)鍵CDR區(qū),即:HCDR2、HCDR3和LCDR3。
　　 確定了抗體抗原結(jié)合的關(guān)鍵CDR區(qū)之后,接下來就是對關(guān)鍵CDR區(qū)實施單點突變,以此獲得每個關(guān)鍵CDR區(qū)的突變熱點及其氨基酸變化規(guī)律。根據(jù)突變熱點及其氨基酸變化規(guī)律,設(shè)計簡并引物,構(gòu)建了3個親和力成熟初級噬菌體文庫HCDR2、HCDR3和LCDR3,庫容大小分別為2.0×109、1.66×109和1.68×108。以p24作為抗原,用固相篩選的方法對初級噬菌

4、體文庫進行篩選,每個初級庫篩選三輪,并分別挑取一定數(shù)目的單克隆菌落進行檢測。再以初級噬菌體文庫篩選三輪后的多樣性克隆序列為模板,進一步構(gòu)建親和力成熟次級噬菌體文庫9E8HK(庫容:8×100),用更加苛刻的篩選條件對其進行篩選。然后,挑取800個單克隆菌落進行檢測,并用ScFv競爭的方法對高親和力噬菌體單鏈抗體進行初步篩選,最終8個結(jié)合活性最好的克隆進行真核表達,得到了一株親和力提高5.7倍的抗體9E8HK-491,其親和力達到5.64