論文1-一11β-羥化酶缺陷癥家系分子致病機制研究;論文2-促甲狀腺激素對冠心病患者血脂水平的影響研究.pdf

1、本文分為二部分：
　　 論文1、一11β-羥化酶缺陷癥家系分子致病機制研究
　　 研究背景:
　　 先天性腎上腺皮質增生癥(congenital adrenal hyperplasia，CAH)是內分泌系統最常見的遺傳性疾病之一，屬于常染色體隱性遺傳性疾病，由皮質激素合成酶基因突變致腎上腺皮質類固醇激素合成障礙所引起。
　　 CAH是由于皮質類固醇激素合成過程中任何一種酶先天性缺陷，引起腎上腺皮質束狀帶合

2、成的皮質醇完全或部分缺乏，經下丘腦-垂體-腎上腺軸反饋調節(jié)，引起促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH-)和促腎上腺皮質激素(ACTH)分泌增加，導致了腎上腺皮質增生，另一方面，某一酶的缺陷也使得皮質醇生物合成鏈中缺陷酶近端的前體產物因不能繼續(xù)向下游合成而堆積，和雄激素的過度生成。CAH臨床主要特點為腎上腺皮質功能不全，性腺發(fā)育異常，伴或不伴水鹽代謝紊亂，高血壓。本癥表現出女性男性化或性幼稚，男性假性性早熟或女性化，失鹽或非失鹽，高血壓等一系

3、列癥狀。
　　 典型CAH的發(fā)病率約為1/10000，而非典型的發(fā)病率約為典型的10倍，因其臨床表現錯綜復雜，且對疾病認識及實驗室檢查技術的不足，診斷方面尚存在許多困難，一般需要從臨床表現，實驗室檢查和基因分析三方面進行綜合診斷。目前CAH基因缺陷的相關檢測技術沒有推廣，在我國臨床工作中尚未常規(guī)開展。
　　 11β-羥化酶缺陷癥(steroid11β-hydroxylase deficiency,11-OHD，OMIM:

4、+202010)是CAH中第二大類型，約占5～8％，發(fā)病率約為1/100，000至1/200，000。11β-羥化酶缺乏引起皮質醇合成減少，對ACTH的反饋抑制減弱，使下丘腦和垂體分泌的CRH及ACTH增加，導致束狀帶產生更多的皮質醇前體。這些前體物質通過旁路代謝，在網狀帶產生大量雄激素，導致高雄激素血癥。此外，11-去氧皮質酮和11-去氧皮質醇水平升高，由于它們具有類鹽皮質激素的作用，從而引起水鈉潴留、高血壓及低鉀血癥。11β-羥化酶

5、缺陷癥的臨床表現包括經典型和非經典型。經典型11β-羥化酶缺陷癥患者可表現為女性外生殖器男性化，男、女患者都可出現的假性性早熟，由于生長過快骨骺愈合提前引起身材矮小，以及血壓升高、血鉀降低。非經典型在女性患者多表現為月經紊亂，多毛和痤瘡，類似多囊卵巢綜合征的表現;在男性患者可無癥狀。
　　 由于11β-羥化酶缺陷癥的發(fā)病人數較少，其分子遺傳學研究相對較少。現已證實:11β-羥化酶缺陷癥的分子遺傳學缺陷是由于CYP11B1基因突變

6、所致。CYP11B1基因(GeneID:1584; MIM:610613; GenBank: NC_000008.10)位于第8號染色體長臂上的21區(qū)(8q21)，由9個外顯子組成(見圖1-6)，長度為6.03Kbp，編碼503個氨基酸殘基。
　　 CYP11B1基因編碼11β-羥化酶，該酶屬于細胞色素P450蛋白超家族中的一員，在腎上腺束狀帶表達，位于線粒體內膜，催化11-去氧皮質醇和11-去氧皮質酮分別轉變?yōu)槠べ|醇和皮質酮。

7、11β-羥化酶分子量約47kDa，是一種含有血紅素的蛋白，具有依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAPDH)的氧化還原體系，該體系由黃素蛋白——皮質鐵氧還蛋白還原酶及鐵硫蛋白——皮質鐵氧還蛋白構成。細胞色素P450蛋白家族的成員結構高度保守，其核心結構由一個被稱作“曲”的螺旋，一個由J螺旋和K螺旋組成的四螺旋束以及兩套β片層構成。該結構構成了血紅素結合環(huán)、質子傳遞溝和位于K螺旋的絕對保守的“EXXR”模序。
　　 CYP11B

8、1基因產生突變后可引起11β-羥化酶不能表達或表達減少，從而導致11β-羥化酶缺陷癥，并呈常染色體隱性遺傳。目前，已報道的CYP11B1基因突變達70余種，其中有錯義/無義突變、剪接突變、小片段缺失、大片段缺失、插入突變及復雜重組（包括染色體倒位）。
　　 隨著科技進步，應用分子生物學及生物信息學技術，從分子水平對先天性腎上腺皮質增生癥的發(fā)病機制和基因型——表型關系做進一步闡明，這必將是研究的新的切入點，亦為研究的重點，從而為其

9、防治提供科學依據，以便更早地控制疾病的發(fā)生與發(fā)展，通過基因診斷及治療，降低其發(fā)病率，延緩疾病進展。
　　 研究目的:本研究通過對一個11β-羥化酶缺陷癥家系中先證者及其家系成員CYP11B1基因的突變篩查，利用微小基因模型研究缺失突變的剪切機制，進而探索該11β-羥化酶缺陷癥家系的分子遺傳學機制。
　　 研究方法:留取先證者及其他家系成員的外周血標本，提取基因組DNA;根據基因庫中CYP11B1基因的序列，利用prime

10、r experss2.0軟件設計引物，分別擴增該基因的9個外顯子及其周圍內含子序列。以家系成員的基因組DNA分別作為模板，進行PCR擴增，擴增產物純化后應用美國ABI PRISM3700 DNA自動測序儀進行測序，然后利用Autoassembler2.0軟件將測序結果與UCSC數據庫下載的基因組序列進行比較、分析，找出突變位點。由于發(fā)現的是大片段缺失突變，缺失片段包含外顯子及內含子的5'剪切供體位點，將影響mRNA的剪接，因此我們進一步

11、利用小基因模型(minigen)技術進行mRNA體外剪接研究，以明確該突變對11β-羥化酶的結構和功能造成的影響。首先，我們將包含CYP11B1基因的第3-6外顯子的野生型及突變型片段構建到pcDNA3.1(+)質粒中，測序證實后轉染293T細胞，提取RNA，以特異引物進行RT-PCR，擴增產物測序，并進行比對分析。
　　 研究結果:
　　 1、家系資料:先證者李登科，男性，4歲6個月，因“身高增長過速2年半，乳腺及外生

12、殖器發(fā)育1年半，加重半年”就診。患者系足月順產，頭先露，出生時體重3.0kg，身長55cm，無抽搐，母乳喂養(yǎng)。患者于2年半之前出現身高增長過速，身高顯著高于同齡其他兒童，且飲食量增加，智力較同齡兒童無明顯差別。當時未行診治。1年半之前出現乳腺及外生殖器發(fā)育，陰毛生長，陰莖可勃起，無遺精，期間身高一直在增加，遂到當地醫(yī)院就診，囑暫予觀察，未行其它特殊處理。半年前患者上述癥狀進一步加重，遂于半個月前赴濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢查，查血鉀:2.60

13、mmol/L，血清FT3:8.23pmol/L，雌二醇:55.05pg/ml，促黃體生成素:＜0.100mIU/ml，促卵泡成熟激素:＜0.100mIU/ml，未行特殊治療，建議到上級醫(yī)院做進一步檢查。查體:T36.7℃，P84次/分，R19次/分，BP143/93mmHg，H134cm，W29.5kg，神志清，反應靈敏，會陰部皮膚顏色加深。無胡須，有喉結，兩乳房發(fā)育。雙肺呼吸音清，未聞及干濕性羅音。心率84次/分，律不齊，各瓣膜聽診區(qū)

14、未聞及病理性雜音。腹部平坦，未見腸型及蠕動波，腹軟、無壓痛反跳痛，肝脾肋下未及，Murphy征陰性，肝區(qū)及腎區(qū)無叩擊痛，腸鳴音正常。外生殖器發(fā)育，陰莖及雙側睪丸增大，無尿道下裂，外陰部陰毛生長。輔助檢查示:血堿性磷酸酶365U/L，總膽固醇2.31 mmol/L，鉀2.7mmol/L，肝功生化其他項目在正常范圍;甲功5項正常，β-HCG小于0.1mIU/ml, FSH0.23 mIU/ml, LH小于0.1 mIU/ml, E238.1

15、0 mg/ml, PRG1.56ng/ml，TO1.14 ng/ml，PRL9.94ng/ml，皮質醇66.98nmol/L（8點），71.15nmol/L（16點），ACTH1534pg/ml（8點），582.8pg/ml（16點）。X線片:腕骨二次骨化中心出現8塊。尺、橈骨遠端骨骺出現，但未閉合，掌指骨二次骨化中心出現，部分閉合，左膝骨骺未閉合。B超:前列腺發(fā)育，符合左腎上腺腺瘤聲像圖表現(左腎上腺低回聲結節(jié)，約0.8×0.7×0.

16、5cm)。最后診斷:先天性腎上腺皮質增生癥，11-β羥化酶缺陷癥并混合性性早熟?；颊吒改赶到H結婚，表型正常，患者有一姐姐，表型正常。
　　 2、CYP11B1基因突變篩查結果:經過測序和序列比對分析，發(fā)現CYP11B1基因的第3-5外顯子之間缺失449bp，患者為純合缺失，而其父母、姐姐為雜合缺失。缺失的片段包括:第3外顯子的3'端，全部內含子3和外顯子4，第4內含子的5'剪切供體位點，其他外顯子測序未發(fā)現突變位點。
　

17、　 3、致病機制研究結果:CYP11B1基因缺失突變(g.2697de1449)將導致相應的mRNA缺失部分3號外顯子和全部4號外顯子，同時插入部分4號內含子序列，更重要的是，造成了從第167位氨基酸開始出現讀碼框改變，產生了大量錯誤的密碼子，并在第217位氨基酸處產生了終止密碼，造成翻譯的CYP11B1蛋白出現提前終止，并完全破壞了該酶的血紅素結合結構域，使該酶的活性完全喪失。
　　 結論:通過對一個漢族11-β羥化酶缺陷癥

18、家系進行突變篩查，我們在國際上首次發(fā)現了CYP11B1基因上一個新的大片段缺失突變(g.2697de1449)，通過小基因系統模擬mRNA剪接，發(fā)現該缺失突變導致產生截斷的蛋白，喪失了與血紅素結合的結構域，造成11-β羥化酶功能完全喪失。CYP11B1基因缺失突變(g.2697de1449)是該11-β羥化酶缺陷癥家系的致病突變。
　　 論文2、促甲狀腺激素對冠心病患者血脂水平的影響研究
　　 研究背景：促甲狀腺激素（t

19、hyroid stimulating hormone, TSH）與促甲狀腺激素受體（TSHR）是人體內參與甲狀腺功能調控的兩種重要蛋白分子。TSHR主要存在于甲狀腺濾泡細胞膜上,生理情況下TSH與其結合后介導調節(jié)甲狀腺濾泡細胞的正常生長和功能。近年來的研究證實,TSHR除存在于甲狀腺濾泡細胞膜上外,尚存在于大腦、睪丸、腎臟、心肌、骨骼、胸腺、淋巴細胞、脂肪組織、纖維母細胞和肝細胞等多種甲狀腺外組織和細胞上。TSH可能通過TSHR介導發(fā)揮

20、著廣泛的、非傳統認識的功能作用,TSH的這種甲狀腺外作用受到了廣泛關注成為目前研究的熱點。甲狀腺功能減退癥（hypothyroidism,甲減）是“由于甲狀腺激素缺乏或其生理效應不足所導致的機體代謝活動下降,而引起的一種內分泌疾病,實驗室檢查表現為TSH升高,甲狀腺激素（FT3、FT4）降低”。甲狀腺功能減退癥常伴有血脂紊亂,易于出現動脈粥樣硬化,增加心血管疾病的危險性。亞臨床甲狀腺功能減退癥（subclinical hypothyro

21、idism,亞甲減）亦是一種常見的內分泌專業(yè)亞臨床疾病,主要診斷依據是血清TSH水平增高,而血清FT3、FT4正常。亞臨床甲減患病率較高,社區(qū)調查的患病率為3％～15%不等,女性、老年和高碘攝入量地區(qū)的患病率明顯增加。美國Framingham隊列研究報告：女性13%,男性5.7%；英國Whickham前瞻研究報告：女性7.5%,男性2.8%。亞臨床甲減也常常伴有血脂紊亂,與動脈粥樣硬化和缺血性心臟病密切相關。既往人們一直認為：甲狀腺功能

22、減退癥所伴隨的血脂紊亂是由于甲狀腺激素對血脂代謝的作用所致,但是,很顯然,亞臨床甲減所伴隨的血脂紊亂不能用甲狀腺激素的作用來解釋。促甲狀腺激素（TSH）在甲減及亞臨床甲減患者均明顯升高,但是其對血脂的影響目前研究較少。冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–oronary heart disease）,簡稱冠心病,是“因冠狀動脈粥樣硬化使血管腔狹窄或阻塞,或／和因冠狀動脈功能性改變（痙攣）導致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病”。
　　 近年

23、來,隨著人口老齡化及心血管病危險因素的增加,冠心病的患病率和死亡率逐年升高,是全球死亡率最高的疾病之一,根據世界衛(wèi)生組織2011年的報告,中國的冠心病死亡人數己列世界第二位。由國家心血管病中心編制的《中國心血管病報告2011》指出：“目前我國心血管病患者人數約為2.3億,相當于每10個成年人中有2人患病。對于我國心血管病未來發(fā)展趨勢,報告根據中國冠心病政策模型作出預測：2010年到2030年,如果僅考慮人口老齡化和人口增加的因素,中國3

24、5歲至84歲人群中心血管病事件數將增加50%以上；如果考慮血壓、總膽固醇、糖尿病、吸煙的因素,心血管病事件數將額外增加23%。如果不改善應對措施,2005年至2015年,心血管疾病、卒中和糖尿病將會給中國造成5500億美元的經濟損失”。冠心病的病因至今尚未完全清楚,但其己知的危險因素有許多,如高血壓、血脂異常如高膽固醇血癥和高低密度脂蛋白血癥、糖尿病與胰島素抵抗、年齡、吸煙、飲酒等,積極預防和治療冠心病的危險因素,可降低冠心病患病率及死

25、亡率。近年來,許多臨床研究均顯示甲狀腺功能與冠心病關系密切,而且亞臨床甲狀腺功能減退能增加冠心病的發(fā)病率,是冠心病的重要危險因素之一。因此,對冠心病患者進行甲狀腺功能狀態(tài)分析對于預防和治療冠心病有著重要意義。我們前期基礎研究證實：肝臟細胞表面存在TSHR, TSH與其結合促進肝臟合成膽固醇,在血膽固醇水平升高中發(fā)揮重要的作用。
　　 本研究通過對于冠心病患者甲狀腺功能和血脂水平的分析,著重研究冠心病患者中TSH變化和血清膽固醇水

26、平之間的關系,校正其他可能影響血脂的因素研究TSH和膽固醇之間關系,以期真實客觀的反映TSH和與血脂之間的關系。
　　 研究目的：探討冠心病患者的TSH水平和血脂譜之間的關系。
　　 研究方法：回顧性研究了1302例冠心病患者的資料,所有患者均經過冠狀動脈造影確診,并住院治療。經過排除后,568例患者進入研究。首先對冠心病患者的甲狀腺功能狀態(tài)進行了分析,然后校正性別、年齡、血糖、吸煙狀況及甲狀腺激素水平等因素,應用Pea

27、rson’s相關分析研究了TSH與血脂譜之間的關系。接下來,應用線性回歸分析、通徑分析、主成分回歸分析及偏最小二乘法的方法分別研究了TSH水平對血膽固醇影響的程度。
　　 研究結果：
　　 1、冠心病患者甲狀腺功能狀態(tài)分析顯示：冠心病患者中,甲狀腺功能異常的發(fā)生率是18.66%,其中甲狀腺功能減退癥（臨床型和亞臨床型）的發(fā)生率（15.32%）明顯高于甲狀腺功能亢進癥的發(fā)生率（3.34%）,女性甲功異常的發(fā)生率（26.17

28、%）顯著高于男性（10.37%）。
　　 2、冠心病患者中,隨著TSH水平的升高,高膽固醇的發(fā)生率呈線性增高的趨勢（Pearson’s Chi-squared test, linear trend0.010, p<0.05）。
　　 3、當我們校正性別、年齡、吸煙狀況、空腹血糖及甲狀腺激素的影響后,冠心病患者的TSH水平與血TC水平依然呈顯著正相關（r=0.095,p=0.036）。
　　 4、在冠心病患者中排除

29、性別年齡等因素的影響后,血清膽固醇隨著TSH水平的升高而升高。偏最小二乘法顯示：血清TSH每變化1各單位,血清膽固醇升高0.01558mmol/L。
　　 結論：TSH可以增加冠心病患者的血膽固醇水平。雖然TSH升高血膽固醇的作用較弱,但是仍然具有重要的生理作用及臨床意義。當TSH水平升高,甚至在正常值高限時,就會增加高膽固醇血癥的患病率。對冠心病患者來說,維持血TSH水平在合適的范圍,將有助于控制血脂,減緩動脈粥樣硬化的進展。