豬細小病毒分子流行病學(xué)調(diào)查以及PPV3VP2蛋白免疫特性的研究.pdf

1、豬細小病毒1型(Porcine parvovirus1，PPV1)可導(dǎo)致母豬繁殖功能性障礙，給全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。近年來國內(nèi)外陸續(xù)報道出多種新型的豬細小病毒，其中包括豬細小病毒2型(Porcine parvovirus2，PPV2)、豬細小病毒3型(Porcineparvovirus3，PPV3)、豬細小病毒4型(Porcine parvovirus4，PPV4)、豬類博卡病毒(Porcine boca-like viru

2、s，PBo-likeV)和豬博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)等。本研究同時對上述五種新型豬細小病毒在國內(nèi)的流行概況和變異程度進行了調(diào)研，豐富了其分子流行病學(xué)參考資料;利用大腸桿菌表達系統(tǒng)和昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)同時表達了PPV3VP2完整蛋白和截短蛋白以研究其免疫原性，為PPV3亞單位疫苗的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ);利用PPV3重組VP2蛋白pET-28a-540建立了間接ELISA方法，為PPV3的檢測提供了血清學(xué)檢測手段

3、。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.新型豬細小病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查
　　本研究對2008～2013年期間的308份送檢病料進行了PCR檢測，結(jié)果顯示PPV2、PPV3、PPV4、PBo-likeV和PBoV的檢出率依次為46.4％、21.1％、6.8％、12.3％和5.5％。結(jié)合同批病料的PRRSV和PCV2檢測結(jié)果進行初步分析，結(jié)果顯示PPV3和PRRSV混合感染的幾率為43.1％(28/65)，PBo-likeV和PCV2混

4、合感染的幾率為78.9％(30/38)，提示它們在感染過程中可能存在著協(xié)同作用。比對測序結(jié)果并繪制截短結(jié)構(gòu)基因的進化樹，顯示PPV3、PPV4和PBo-likeV的序列高度保守，而PPV2和PBoV的序列則有較大幅度的變異。
　　2.豬細小病毒3型結(jié)構(gòu)蛋白的原核表達與免疫特性研究
　　本研究將不同大小的PPV3 VP2基因克隆入原核表達載體pET-28a，利用E.coliBL21分別表達重組蛋白pET-28a-540、pET

5、-28a-555和pET-28a-VP2，SDS-PAGE結(jié)果顯示三種蛋白均能正常表達且以包涵體的形式存在，利用包涵體洗液純化得到了高純度的重組蛋白，其中以蛋白pET-28a-540的純度最高。為研究其免疫原性，利用弗氏佐劑將三種蛋白分別制成亞單位疫苗，依次命名為Sub-28a-540、Sub-28a-555和Sub-28a-VP2。小鼠免疫試驗顯示，免疫Sub-28a-VP2的小鼠抗體效價顯著性高于(P＜0.05)免疫Sub-28a-

6、555的小鼠，而免疫Sub-28a-540的小鼠抗體效價居中。
　　3.豬細小病毒3型結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達與免疫特性研究
　　本研究將不同大小的PPV3 VP2基因克隆入真核表達載體pFastBacDual，構(gòu)建了重組桿狀病毒pFastBacDual-540、pFastBacDual-555和pFastBacDual-VP2，經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，三種VP2基因均能在重組病毒中表達。為進一步研究三種

7、蛋白的免疫原性，大量增殖病毒pFastBacDual-555和pFastBacDual-VP2后進行蛋白純化，將純化的蛋白分別制成亞單位疫苗并免疫小鼠。免疫后不同時間采血，測定抗體滴度和細胞因子濃度:間接ELISA檢測結(jié)果表明，兩組疫苗均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較高水平的特異性抗體;夾心ELISA檢測結(jié)果表明，免疫蛋白pFastBacDual-VP2的小鼠體內(nèi)IL-4和IFN-γ的濃度均顯著性升高(P＜0.05)。結(jié)果顯示蛋白pFastBacDu

8、al-VP2可以同時誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答。
　　4.豬細小病毒3型問接ELISA抗體檢測方法的建立和應(yīng)用
　　本研究以純化的重組蛋白pET-28a-540作為包被抗原，利用方陣滴定法建立了PPV3間接ELISA抗體檢測方法。確立的反應(yīng)條件為:最佳抗原包被濃度為0.5μg/m，最佳血清稀釋度為1∶100，最佳抗原包被條件為37℃1h，最佳封閉液為含5％脫脂奶粉的PBST，最佳封閉條件為37℃2h，血清最佳反應(yīng)

9、條件為37℃1h，HRP-SPA的最佳稀釋度和最佳反應(yīng)條件分別為1∶20000和37℃30min，TMB最佳反應(yīng)條件為37℃避光作用6min。依據(jù)統(tǒng)計學(xué)方法確立了陰陽性血清的判定標(biāo)準(zhǔn):P/N＞2.1且OD450nm≥0.318的為陽性，OD450nm＜0.277的為陰性，0.318＞OD450nm＞0.277的為可疑。特異性試驗表明該抗原與CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PRRSV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清無交叉反應(yīng)，顯示出高度的特異性;批內(nèi)和