基于量子點和免疫磁珠技術(shù)同步檢測抗弓形蟲IgG和IgM抗體的實驗研究.pdf

1、弓形蟲病是一種嚴重危害人類健康和影響優(yōu)生優(yōu)育的人畜共患疾病。ELISA法是目前診斷弓形蟲感染的常規(guī)檢測方法，主要是通過檢測特異性IgG(免疫力水平指標)和IgM(近期感染指標)抗體的有無來判斷機體的感染情況，但該方法存在不能同步檢測IgG和IgM抗體，檢測時間長，耗費試劑多，操作繁瑣等缺點。 量子點是一種新型熒光標記材料，與傳統(tǒng)熒光染料相比具有以下優(yōu)點：激發(fā)波長范圍較寬，同一波長的光能激發(fā)不同大小的量子點；發(fā)射波長窄而對稱，同時

2、使用具有不同光譜特征的量子點時，發(fā)射光譜間重疊較少；不同粒徑和組成的量子點其發(fā)射波長不同。因此，應用不同發(fā)射波長的量子點對不同的待檢分析物同時進行標記，可以達到多個指標同時檢測的目的。 本研究將量子點標記技術(shù)與免疫磁珠技術(shù)相結(jié)合，研制了一種可同步檢測抗弓形蟲IgG和IgM抗體的檢測體系，本方法不僅操作簡便快速，還具有較高的特異性和敏感性，可用于弓形蟲感染的篩查。 方法： 1.抗原固化磁性微球 采用碳二亞胺

3、交聯(lián)法將弓形蟲重組抗原固化在羧基磁性微球表面。通過EDC和NHS溶液活化磁珠表面羧基后，活化的羧基再與抗原上的氨基進行反應，從而將弓形蟲抗原固化在磁性微球表面，獲得免疫磁珠。通過對磁性微球的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度等固化條件進行選擇優(yōu)化，建立穩(wěn)定、高效的免疫磁性微球固化方法。 2.量子點標記二抗 采用碳二亞胺交聯(lián)法將羧基化CdS/ZnS量子點與抗體進行標記.分別以發(fā)射波長為580nm、618nm的量子點分別標記羊抗

4、人IgG和羊抗人IgM抗體，研究pH值，二抗加入濃度，反應時間對量子點發(fā)光的影響，制備適用于抗弓形蟲IgG和IgM抗體同步檢測體系的量子點標記二抗試劑。 3.分別建立抗弓形蟲IgG、IgM抗體檢測方法 以固化了弓形蟲抗原的磁性微球作為固相載體，量子點標記二抗作為檢測抗體，采用間接法原理，分別建立抗弓形蟲IgG和IgM抗體的檢測方法，并對檢測條件進行優(yōu)化。分別檢測人抗弓形蟲IgG、IgM標準品，觀察本方法的線性范圍、靈敏度

5、、重復性和準確度。收集臨床標本，分別用本方法與進口ELISA試劑盒進行檢測并對結(jié)果進行比較，觀察兩種檢測方法的結(jié)果有無統(tǒng)計學差異。 4.抗弓形蟲IgG和IgM抗體同步檢測體系的構(gòu)建 在已建立的單個抗體檢測方法的基礎上，對關(guān)鍵檢測條件進行統(tǒng)一和優(yōu)化，構(gòu)建抗弓形蟲IgG和IgM抗體同步檢測體系。同步檢測人抗弓形蟲IgG、IgM標準品，觀察該體系的線性范圍、靈敏度、重復性和準確度。用已構(gòu)建的同步檢測體系對280例臨床標本進行同

6、步檢測，并將結(jié)果與進口ELISA試劑盒進行比較，探討多指標同步檢測的可行性。 主要結(jié)果： 一、方法學建立 (1)抗原固化磁性微球 選擇粒徑為3μm的羧基磁性微球作為固相載體，加入EDC(6mg/ml)和NHS(4mg/ml)溶液進行活化，弓形蟲抗原的最適固化濃度為50μg/mL，固化效率為54.2％。 (2)量子點標記二抗 實驗結(jié)果表明，量子點標記二抗的最適反應pH值為6.0，羊抗人IgG

7、、IgM抗體的最適標記濃度分別為40μg/mL、50μg/mL。 (3)抗弓形蟲IgG、IgM抗體檢測方法的建立 分別建立了抗弓形蟲IgG和IgM抗體檢測方法，經(jīng)過實驗優(yōu)化，量子點羊抗人IgG、IgM的最適工作濃度分別為1:50、I:100，待測血清最適稀釋度均為1:100。通過檢測200例健康人血清樣本確定了抗弓形蟲IgG抗體和IgM抗體Cutoff值分別為：0.45、0.44。 (4)同步檢測抗弓形蟲IgG和

8、IgM抗體檢測體系的建立 同步檢測抗弓形蟲IgG和IgM抗體，量子點標記羊抗人IgG、IgM的最適工作濃度分別為1:200、1:100，待測血清最適稀釋度為1:100。檢測200例健康人血清樣本確定了抗弓形蟲IgG抗體和IgM抗體Cutoff值分別為：0.55、0.51。同步檢測抗弓形蟲IgG和IgM抗體兩個指標，僅需30min就可完成整個檢測過程，而常規(guī)ELISA方法一次只能檢測單個指標，完成兩個指標的檢測往往需要4h。

9、 二、方法學評價 (1)抗弓形蟲IgG、IgM抗體檢測方法的方法學評價 按已建立的方法分別檢測人抗弓形蟲IgG、IgM標準品，其最低檢測限分別為：3.04IU/ml、3.11 IU/ml。批內(nèi)重復性實驗平均CV分別5.2％、5.4％，天間重復性實驗平均CV分別為6.5％，6.6％。準確性實驗偏倚系數(shù)分別為：6.0％，6.3％。20例其它TORCH系列陽性血清標本與本方法均無交叉反應。阻斷實驗結(jié)果顯示，弓形蟲IgG和Ig

10、M抗體的阻斷率均在50％以上。 (2)同步檢測抗弓形蟲IgG、IgM抗體檢測體系的方法學評價 同步檢測人抗弓形蟲IgG和IgM標準品，其最低檢測限分別為：4.211U/ml、4.321U/ml；批內(nèi)重復性實驗平均CV分別為：6.0％、6.2％；天間重復性實驗平均CV為7.2％、7.4％；準確性實驗偏倚系數(shù)分別為：7.6％，7.2％。 三、方法學比較 (1)抗弓形蟲IgG、IgM抗體檢測方法的方法學評價

11、 收集臨床標本，用已建立的抗弓形蟲IgG、IgM抗體檢測方法分別進行檢測，并與進口ELISA試劑盒檢測結(jié)果比較。抗弓形蟲IgG和IgM抗體檢測結(jié)果的符合率分別為：96.5％、96.8％，采用SPSS10.0軟件對數(shù)據(jù)進行配對X2檢驗分析，P值均>0.05，認為兩種方法分別檢測抗弓形蟲IgG和IgM抗體的測定結(jié)果無顯著性差異。 (2)同步檢測抗弓形蟲IgG和IgM抗體檢測體系的方法學評價 收集臨床標本，用已構(gòu)建的抗弓形

12、蟲IgG、IgM抗體同步檢測體系進行同步檢測，并與進口ELISA試劑盒檢測結(jié)果比較。弓形蟲IgG和IgM抗體檢測結(jié)果的符合率分別為：96.4％，97.1％，采用SPSS10.0軟件對數(shù)據(jù)進行配對X2檢驗分析，P值均>0.05，認為本方法同步檢測抗弓形蟲IgG和IgM抗體的測定結(jié)果與ELISA法無顯著性差異。 結(jié)論： 1.以磁性微球作為固相載體，在其表面成功固化了弓形蟲重組抗原，固化效率最高可達54.2％。利用磁珠可快速富

13、集的特性，在加快了檢測速度同時，也極大的提高了檢測靈敏度。本法同步檢測抗弓形蟲IgG和IgM抗體僅需30 min，較ELISA法的2.5h明顯加快。 2.建立的抗弓形蟲IgG、IgM抗體單指標檢測方法，其靈敏度、檢測范圍、重復性、穩(wěn)定性等達到臨床初步應用的要求，為同步檢測體系的建立奠定了基礎。 3.選用不同發(fā)射波長的量子點分別標記不同二抗，經(jīng)同一激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射兩種不同波長的光，實現(xiàn)了多指標的同步檢測，為基于量子點標記同