DT390與TMTP1融合毒素的構建及其靶向治療高轉移性腫瘤的研究.pdf

1、華中科技大學博士學位論文DT390與TMTP1融合毒素的構建及其靶向治療高轉移性腫瘤的研究姓名：葉雙梅申請學位級別：博士專業(yè)：婦產(chǎn)科學指導教師：王世宣2011-05華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文 華 中 科 技 大 學 博 士 學 位 論 文 2方法 方法 1. DT390-TMTP1 和 DT390-biTMTP1 融合毒素的基因構建、表達及純化（1）PCR擴增基因片段，酶切回收，插入到 pET28a（+）表達載體，構

2、建重組質粒 pET28a（+）/ DT390-TMTP1 與 pET28a（+）/ DT390-biTMTP1。 （2）按轉化操作方法將重組質粒轉入 BL21（λ DE3）感受態(tài)宿主細胞，IPTG 誘導表達。（3）超聲裂菌法提取包涵體，Ni-NTA His?Bind 樹脂親和純化，SDS-PAGE 膠檢測包涵體的量及純度。（4）稀釋復性法將包涵體復性，超濾管濃縮。（5）SWISS-MODEL 分析DT390-TMTP1 和 DT390-

3、biTMTP1 融合蛋白的晶體結構。 2. 體外實驗研究 DT390-TMTP1 和 DT390-biTMTP1 融合蛋白對腫瘤細胞和正常細胞的毒性作用（1）1-6μg/ml 的 DT390-TMTP1 和 DT390-biTMTP1 融合蛋白分別作用于胃癌細胞 MKN-45，前列腺癌細胞 PC-3M-1E8 及正常人胚腎細胞 HEK293，24 小時后通過 MTT 實驗檢測各濃度對細胞存活率的影響。（2） MTT 法比較TMTP1 肽

4、、 DT390-TMTP1 和 DT390-biTMTP1 融合毒素對 PC-3M-1E8， MKN-45，HEK293 的細胞殺傷效應。（3）流式細胞術檢測 TMTP1 肽、DT390-TMTP1 和DT390-biTMTP1 融合毒素作用后 PC-3M-1E8， MKN-45 及 HEK293 細胞的凋亡率。（4）普通光學顯微鏡下觀察 TMTP1，DT390-TMTP1 及 DT390-biTMTP1 融合蛋白引起 PC-3M-1E

5、8，MKN-45 及 HEK293 細胞形態(tài)學變化。（5）Confocol 檢測TMTP1，DT390-TMTP1 及 DT390-biTMTP1 融合蛋白引起 PC-3M-1E8，MKN-45及 HEK293 細胞核的變化。 3. DT390-biTMTP1 融合蛋白體內分布及腫瘤靶向治療的體內研究（1）建立前列腺癌和胃癌皮下瘤模型。 （2）前列腺癌和胃癌皮下瘤裸鼠分組經(jīng) TMTP1 肽、DT390-TMTP1 和 DT390-biT

6、MTP1 融合毒素處理，觀察腫瘤大小及裸鼠生存率。（3）胃癌原位瘤裸鼠分組經(jīng) TMTP1 肽、DT390-TMTP1 和 DT390-biTMTP1 融合毒素處理，觀察原發(fā)灶及轉移灶的發(fā)生率。（4）免疫組化檢測 DT390-biTMTP1融合蛋白在荷瘤裸鼠體內的分布與代謝。（5）免疫組化檢測 TMTP1 肽、DT390-TMTP1 和 DT390-biTMTP1 融合毒素處理的各組胃癌皮下瘤組織中細胞增殖（Ki67）與凋亡（Caspas