尿激酶型纖溶酶原激活劑和肝細胞生長因子聯(lián)合基因治療實驗性肝纖維化.pdf

1、該研究選擇HGF和uPA作為外源目的基因，利用AdEasy<'TM>系統(tǒng)分別構建表達HGF和非分泌型uPA的重組復制缺陷型腺病毒AdHGF和AduPA，通過體外、體內實驗研究HGF和uPA聯(lián)合基因治療肝纖維化的效果，為多靶點協(xié)同治療肝纖維化提供實驗依據(jù).實驗方法：一、重組復制缺陷型腺病毒AduPA和AdHGF構建及體外表達.分別將HGF和uPA的表達質粒酶切、PCR擴增，獲取HGF和uPA cDNA片段.其中在uPA cDNA片段兩端分

2、別連接RR固定信號序列和KDEL信號序列進行修飾，使其表達的uPA蛋白兩端能分別與內質網(wǎng)膜上的Ⅰ、Ⅱ型跨膜蛋白相結合而固定于細胞內，避免uPA大量分泌到細胞外，影響凝血功能.二、HGF和uPA基因過表達對細胞生物學特性影響.1.利用AdHGF導入外源HGF基因對肝細胞增殖的影響：分離制備原代培養(yǎng)的Sprague-Dawley(SD)大鼠肝細胞，AdHGF以一定滴度體外感染肝細胞，利用RT-PCR法檢測肝細胞HGF和c-met/HGF受體

3、mRNA的表達，ELISA法測定培養(yǎng)上清HGF水平;繪制感染前后細胞增殖曲線;流式細胞儀測定基因導入前后細胞周期變化;免疫細胞熒光法檢測HGF基因導入后增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表達并計算PCNA指數(shù).2.利用AduPA導入外源uPA基因對HSC生物學特性的影響：AduPA以一定滴度感染肝星狀細胞株HSC-T6，Northern印跡法和免疫細胞化學法檢測uPA在HSC

4、中的表達;ELISA法檢測培養(yǎng)上清MMP-2及TGF-β<,1>水平;免疫細胞熒光法測定Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的變化.三、AdHGF和AduPA體內導入對實驗性肝纖維化的基因治療效果：將雄性SD大鼠隨機分為6組，每組10只.第1組予橄欖油（3ml/kg）皮下注射作為正常對照組;第2～6組為肝纖維化模型組，予40％四氯化碳（CCl<,4>）3ml/kg皮下注射，3天注射1次，首劑加倍，共注射18次.其中第2組設為模型對照組;第3組為空白病毒Ad

5、GFP對照組，于注射CCl<,4>8次后經(jīng)尾靜脈導入4×10<'9>pfu AdGFP至大鼠體內;第4組設為AdHGF導入組，于注射CCl<,4>8次后經(jīng)尾靜脈導入2×10<'9>pfu AdHGF+2×10<'9>pfu AdGFP;第5組為AduPA導入組，于注射CCl<,4>8次后經(jīng)尾靜脈導入2×10<'9>pfu AduPA+2×10<'9>pfu AdGFP;第6組為AdHGF+AduPA聯(lián)合治療組，于注射CCl<,4>8次后

6、經(jīng)尾靜脈導入2×10<'9>pfu AdHGF和2×10<'9>pfu AduPA.CCl<,4>注射18次后處死大鼠，分別觀察各組大鼠肝功能指標及凝血酶原時間（PT）變化，ELISA法測定血清Ⅲ型前膠原氨基端肽（PⅢP）和透明質酸（HA）水平，免疫組織化學法測定HGF、uPA、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達，圖象分析儀半定量分析;肝組織切片采用HE和VG染色測定ECM含量并對肝纖維化程度分級.四、統(tǒng)計學處理：數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件

7、包進行分析，結果以X±S表示.多組間采用One-Way ANOVA分析，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗;細胞周期分析采用X<'2>檢驗.P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為具有非常顯著性差異.結論：1.利用AdEasy<'TM>系統(tǒng)可快速構建插入外源HGF和非分泌型uPA基因的重組復制缺陷型腺病毒并可在體內外高效表達.2.HGF基因導入大鼠肝細胞過表達后可上高c-met受體轉錄活性;誘導調節(jié)肝細胞通過細胞周期G<,1>/S節(jié)點并增強

8、PCNA表達，促進肝細胞增殖.3.uPA基因導入大鼠HSC細胞過表達后可提高培養(yǎng)上清MMP-2濃度，降低Ⅰ、Ⅲ型膠原含量.4.HGF體內單獨導入可改善肝功能，降低肝纖維化大鼠肝內ECM沉只，抑制肝纖維化發(fā)展.5.uPA體內單獨導入亦可明顯減少ECM含量，但肝功能未有明顯改善，其對肝纖維化的主要作用是降解ECM.6.AduPA和AdHGF聯(lián)合基因治療既可明顯抑制ECM沉積，還能促進肝功能恢復，治療效果優(yōu)于單基因導入治療，是治療實驗性肝纖維