重組型纖溶酶原激活劑修飾納米粒的血栓靶向溶栓特性研究.pdf

1、多項臨床研究表明,80％腦卒中患者是由腦血栓導(dǎo)致。目前,腦血栓的治療手段十分局限,持續(xù)靜脈滴注組織型纖溶酶原激活劑(rtPA)是唯一被FDA批準(zhǔn)的治療方法,即便如此,rtPA的使用也僅限于癥狀出現(xiàn)的3個小時之內(nèi),同時還存在并發(fā)腦出血的危險,尤其是對超過這個治療時間窗的患者,腦出血風(fēng)險將會顯著增加,因而嚴(yán)重限制了rtPA的應(yīng)用。在臨床上,能受益于rtPA治療的腦血栓患者不足5％。此外,rtPA溶栓療法僅對部分患者有效,血管再通后,仍有較高

2、的腦血栓再阻塞率。因此,腦血栓治療迫切需要提高rtPA溶栓效果以及安全性。
　　提高rtPA對纖維蛋白的親和力、延長其半衰期以及與其他藥物聯(lián)合治療是提高rtPA溶栓效果以及安全性的主要手段。納米藥物作為一種新型的制劑有一般藥物無法比擬的優(yōu)勢。首先,納米粒子內(nèi)部可以裝載治療藥物、診斷性藥物,并且表面可連接各種生物活性分子;其次,納米粒子具有豐富的表面積,可用于連接數(shù)量可觀的生物活性分子。另外,納米粒子具有多價性,可連接多個生物活性分

3、子,從而提高對病灶的靶向性。納米粒子還可經(jīng)聚乙二醇(PEG)修飾,從而顯著延長藥物的半衰期。因此,借助納米材料提高rtPA對腦血栓的靶向性可以減少rtPA對纖維蛋白原的酶解,防止出血的發(fā)生;同時延長其半衰期可以減少給藥劑量,可以簡化給藥方式,從而提高rtPA溶栓效果以及安全性。
　　本研究旨在構(gòu)建rtPA修飾的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米靶向溶栓載藥系統(tǒng),并評價其血栓靶向性、溶栓效果以及安全性,為實現(xiàn)血栓聯(lián)合治療提供新策略。
　　

4、本文第一部分為rtPA修飾的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒的構(gòu)建與表征。通過單次乳化法制備聚乙二醇-聚丙交酯納米粒(NP)、EDC/NHS法與rtPA形成共價連接,制得rtPA-NP。通過動態(tài)光散射法檢測納米粒子粒徑、粒徑分布寬度以及表面膜電位;透射電鏡觀察納米粒子形態(tài);免疫膠體金染色電鏡觀察rtPA于納米粒子表面的分布情況,通過 BCA法檢測rtPA蛋白連接效率;生色底物法檢測rtPA-NP的rtPA活性以及4度保存一周活性變化。結(jié)果表明:

5、rtPA-NP粒徑為129nm,連接效率為54.6±2.8％,每毫克納米粒連接有49.2ug rtPA,電鏡顯示粒子光滑圓整,表面有rtPA的存在;rtPA-NP活性為游離rtPA的73％,且4℃保存一周活性改變。
　　本文第二部分為rtPA-NP的藥代動力學(xué)評價。SD大鼠尾靜脈注射香豆素-6標(biāo)記的rtPA-NP(20mg/kg)或游離rtPA(1mg/kg),不同時間點采血,熒光分光光度法檢測血藥濃度并繪制rtPA-NP藥時曲線

6、,進(jìn)而計算rtPA-NP藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):RtPA-NP半衰期為92min,為游離rtPA的18倍,適合作為靶向溶栓制劑。
　　本文第三部分為rtPA-NP對血栓的靶向性以及溶栓特性研究。高效液相法分別檢測體外制備的纖維蛋白血凝塊與香豆素-6標(biāo)記的NP和rtPA-NP的結(jié)合情況;免疫熒光技術(shù)觀察腦血栓模型中納米藥物與纖維蛋白血凝塊定位情況。通過rtPA-NP與血凝塊孵育后稱重法,評價其體外溶栓能力,mNSS評分評價大鼠神經(jīng)

7、損傷程度,TTC染色并計算腦梗死體積。收集腹主動脈血,采用Sysmex CA-7000凝血分析儀檢測PT、APTT、Fbg、D-二聚體等出凝血指標(biāo)。結(jié)果表明:RtPA-NP組和纖維蛋白血凝塊結(jié)合的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于NP組,且腦血栓模型中rtPA-NP同樣可以靶向纖維蛋白血栓;生理鹽水組、游離 rtPA組、rtPA-NP組的腦梗死體積分別為381mm3、383mm3、127mm3,rtPA-NP組腦梗面積僅為生理鹽水組33.3％(n=6,P

8、<0.001);rtPA-NP組神經(jīng)損傷評分也相應(yīng)好轉(zhuǎn)(n=10,P<0.05);RtPA-NP對APTT、PT、Fbg無影響,而血中D-二聚體含量顯著增加。
　　本研究構(gòu)建的rtPA-NP載藥系統(tǒng),不僅保留了rtPA的活性和良好的血栓靶向性,而且顯著延長了其半衰期,簡化了給藥方式。RtPA-NP血栓靶向給藥系統(tǒng)構(gòu)建成功,為血栓治療提供了新途徑,為以后結(jié)合抗凝藥和血管保護(hù)藥物,實現(xiàn)血栓的聯(lián)合治療,開發(fā)安全、高效的溶栓藥物奠定了基礎(chǔ)