甲型流感病毒各亞型假病毒系統(tǒng)的構(gòu)建及H1亞型特異性保守表位的鑒定.pdf

1、甲型流感病毒可引起年度季節(jié)性流感和反復(fù)的流感大流行，嚴(yán)重危害人民健康。近年來(lái)甲型H1N1流感的流行和人感染H5N1禽流感病毒病例不斷增加，進(jìn)一步提示加強(qiáng)甲型流感病毒的研究和防控的重要性。血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)是甲型流感病毒編碼的表面糖蛋白。根據(jù)HA和NA的抗原性，甲型流感病毒可分為16個(gè)HA亞型(H1～H16)和9個(gè)NA亞型(N1～N9)。HA和NA的重組和重配產(chǎn)生新的病毒是造成流感大流行的重要原因。理論上16個(gè)HA和9個(gè)N

2、A亞型可自由組合形成144種亞型流感病毒，多數(shù)亞型流感病毒已在自然界被發(fā)現(xiàn)，但引發(fā)大流行的流感病毒的亞型種類(lèi)仍無(wú)法預(yù)測(cè)。因此，加強(qiáng)亞型特異性快速診斷、加強(qiáng)監(jiān)測(cè)能力以及時(shí)發(fā)現(xiàn)流行的流感亞型的變化是應(yīng)對(duì)流感大流行重要基礎(chǔ)。為此，本研究構(gòu)建了涵蓋各亞型流感假病毒系統(tǒng)，為流感病毒中和抗體的快速檢測(cè)鑒定以及深入研究HA和NA的功能提供材料和手段;另一方面，通過(guò)建立基于表位的甲型流感病毒亞型特異性檢測(cè)技術(shù)為發(fā)展新型的流感病毒亞型檢測(cè)、監(jiān)測(cè)技術(shù)提供基

3、礎(chǔ)和依據(jù)。
　　 一、甲型流感病毒各亞型假病毒系統(tǒng)的構(gòu)建
　　 構(gòu)建了16個(gè)HA亞型(H1～H16)的真核表達(dá)質(zhì)粒，用相應(yīng)的亞型特異性抗體對(duì)HA的表達(dá)進(jìn)行了免疫印跡驗(yàn)證，結(jié)果表明所有16個(gè)亞型HA均獲得表達(dá)。對(duì)除H5和H7外的14個(gè)亞型HA的切割位點(diǎn)進(jìn)行了改造，將切割位點(diǎn)由單堿性氨基酸突變?yōu)槎鄩A性氨基酸，免疫印跡結(jié)果表明切割位點(diǎn)改造不影響HA的表達(dá)，其中H1、H6、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和H

4、16HA經(jīng)改造后發(fā)生切割，H2、H3、H4和H8HA改造后仍未切割。同時(shí)，構(gòu)建了9個(gè)亞型NA(N1～N9)的真核表達(dá)質(zhì)粒，用亞型特異性抗體(N3～N9)進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)驗(yàn)證了相應(yīng)NA的表達(dá)，并用商品化的神經(jīng)氨酸酶檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞裂解液的酶活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明9個(gè)NA的裂解液中具有很強(qiáng)的神經(jīng)氨酸酶活性，間接證明了9個(gè)NA亞型的正確表達(dá)。
　　 將16個(gè)HA亞型和9個(gè)NA亞型組合包裝假病毒，144種假病毒感染293T細(xì)胞的結(jié)果根

5、據(jù)HA的切割情況及與不同NA組合的感染能力可分為四組。H5、H6、H7和H94個(gè)HA亞型均切割表達(dá)且與9個(gè)NA形成的假病毒均能感染細(xì)胞；H1、H10～H168個(gè)HA亞型能切割表達(dá)但只有與部分NA形成的假病毒具有感染性；H2和H8兩個(gè)HA亞型不切割但與部分NA形成的假病毒具有感染性；H3和H4兩個(gè)HA亞型不切割且與所有NA形成的假病毒都不能感染細(xì)胞。這些結(jié)果提示不同亞型HA在切割性和假病毒感染性上存在很大差異，HA和NA在假病毒水平上存在

6、相互作用的可能，其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。胰酶處理增強(qiáng)了原先不能感染的H3和H4假病毒的感染性。我們對(duì)于構(gòu)建的假病毒通過(guò)以下三種方法進(jìn)行了驗(yàn)證，電鏡下能觀察到完整的病毒粒子形態(tài)，免疫印跡結(jié)果表明HA均摻入相應(yīng)的假病毒，血凝試驗(yàn)表明摻入假病毒的HA具有生物學(xué)活性。最后，用H1、H3、H5和H7假病毒與相應(yīng)抗體進(jìn)行了假病毒中和試驗(yàn)，結(jié)果表明H1、H3、H5、H7假病毒可被相應(yīng)抗體中和，初步說(shuō)明我們所構(gòu)建的假病毒可用于中和抗體的檢測(cè)和評(píng)價(jià)

7、。
　　 二、甲型流感病毒H1亞型特異性保守表位的鑒定和應(yīng)用
　　 用H1N1甲型流感(H1N1pdm)病毒HA蛋白胞外區(qū)的合成肽庫(kù)和H1N1甲流病人恢復(fù)期血清進(jìn)行肽掃描分析，成功鑒定了五條免疫優(yōu)勢(shì)肽，分別是P3(38-52aa)、P5(58-72aa)、P15(158-172aa)、P16(168-182aa)和P31(318-332aa)。除P15外，其余四條合成肽偶聯(lián)物在小鼠中誘導(dǎo)出較強(qiáng)的抗體滴度，免疫印跡和ELI

8、SA試驗(yàn)表明P3、P5和P31三條肽含有H1N1pdm病毒的優(yōu)勢(shì)表位。進(jìn)一步的免疫印跡分析表明P5和P31只與H1亞型HA蛋白反應(yīng)，且與多個(gè)不同年代來(lái)源的H1亞型HA均反應(yīng)，，說(shuō)明P5和P31為H1亞型保守的特異性表位。氨基酸序列比對(duì)分析和Insilico保守性分析表明P5表位在H1亞型HA中高度保守，但在H2～H16HA中幾乎不存在。P5表位是一個(gè)從未被報(bào)道的線性表位，它位于傳統(tǒng)的五個(gè)抗原位點(diǎn)區(qū)之外。以此表位作為抗原建立的合成肽ELI

9、SA方法與傳統(tǒng)的血凝抑制試驗(yàn)相比具有很高的相關(guān)性(X2=58.01，P＜0.01)。兩種方法的一致性為87％，以血凝抑制試驗(yàn)作為標(biāo)準(zhǔn)方法，合成肽ELISA的靈敏度和特異性分別為96.5%和74.4%。
　　 綜上所述，本研究首次建立了可涵蓋甲型流感病毒已知的16個(gè)HA亞型及9個(gè)NA亞型的假病毒系統(tǒng)，并在假病毒水平上提示了HA和NA存在相互作用的可能；利用合成肽掃描技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)一個(gè)H1亞型特異且高度保守的線性表位，利用該表位建立了