腎癌組織特異性復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、分類號(hào)：分類號(hào)：R69密級(jí)：密級(jí)：公開(kāi)公開(kāi)研究生學(xué)位論文論文題目（中文）論文題目（中文）腎癌組織特異性復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)腎癌組織特異性復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定建及鑒定論文題目（外文）論文題目（外文）Constructionidentificationoftumspecificreplicationdefectiverecombinantadenovirusinkidney研究生姓名研究生姓名張楊張楊學(xué)科、專業(yè)學(xué)科、專業(yè)外科

2、學(xué)科學(xué)泌尿外科學(xué)泌尿外科學(xué)研究方向研究方向泌尿系腫瘤泌尿系腫瘤學(xué)位級(jí)別學(xué)位級(jí)別碩士碩士導(dǎo)師姓名、職稱導(dǎo)師姓名、職稱田俊強(qiáng)田俊強(qiáng)副教授副教授論文工作起止論文工作起止20142014年7月至月至20162016年3月論文提交日期論文提交日期2012016年4月論文答辯日期論文答辯日期2012016年5月學(xué)位授予日期學(xué)位授予日期校址：甘肅省蘭州市校址：甘肅省蘭州市蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文腎癌組織特異性復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定腎癌組織

3、腎癌組織特異性復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定特異性復(fù)制缺陷型重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定中文摘要中文摘要目的：目的：構(gòu)建腎癌組織特異性復(fù)制缺陷型5型腺病毒Ad5CAIXE1AIREShrGFP1，該病毒攜帶腎癌組織特異性啟動(dòng)子碳酸酐酶IX和報(bào)告基因人源型綠色熒光蛋白(hrGFP1)，為外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的檢測(cè)等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。方法：方法：利用BglII、PmeI雙酶切穿梭質(zhì)粒pShuttleCMVIREShrGFP1、pSh

4、uttleCAIXE1A分別得到目的片段hrGFP1及基因載體，T4DNA連接酶過(guò)夜連接，構(gòu)建含有報(bào)告基因的重組穿梭質(zhì)粒pShuttleCAIXE1AIERShrGFP1。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α后經(jīng)涂板、PCR、酶切鑒定，挑選陽(yáng)性菌落大量擴(kuò)增，獲取重組質(zhì)粒。提取的陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)PmeI線性化，轉(zhuǎn)化含有骨架質(zhì)粒AdEasy1的感受態(tài)細(xì)胞BJ5183，利用同源重組技術(shù)，構(gòu)建病毒質(zhì)粒pAd5CAIXE1AIREShrGFP1。經(jīng)PCR、酶切共同鑒

5、定，陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH5α中大量擴(kuò)增、提取并凍存菌液。陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)PacI酶切后，線性化質(zhì)粒利用Lipofectamin2000TM介導(dǎo)作用，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，獲得重組腺病毒Ad5CAIXE1AIREShrGFP1，經(jīng)4輪擴(kuò)增后收集、純化病毒，檢測(cè)其滴度。結(jié)果：結(jié)果：成功構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒、重組腺病毒質(zhì)粒并且完成其包裝過(guò)程。PCR和酶切的電泳結(jié)果顯示，hrGFP1基因成功嵌入重組穿梭質(zhì)粒及腺病毒質(zhì)粒，酶切分析與VectNTIA

6、dvance11軟件結(jié)果一致，證實(shí)重組穿梭質(zhì)粒pShuttleCAIXE1AIREShrGFP1及腺病毒質(zhì)粒pAd5CAIXE1AIREShrGFP1構(gòu)建正確；在病毒包裝和后續(xù)四輪擴(kuò)增過(guò)程中，重組腺病毒在HEK293細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)正常，細(xì)胞病變明顯，證實(shí)病毒包裝成功，經(jīng)檢測(cè)其滴度為1.871010pfuml。結(jié)論：結(jié)論：攜帶報(bào)告基因的腎癌組織特異性復(fù)制缺陷型5型腺病毒構(gòu)建成功，重組后的病毒Ad5CAIXE1AIREShrGFP1，為外周