水稻CDPKs基因的表達及其功能研究.pdf

1、植物鈣依賴的蛋白激酶(CDPKs)是細胞鈣信號的受體，在植物生長發(fā)育、病原防御、非生物環(huán)境脅迫、離子通道運輸?shù)壬矸磻男盘杺鬟f過程中起著重要的調(diào)控作用。水稻存在多個CDPKs基因，有少數(shù)幾個基因的功能比較清楚，它們與水稻的發(fā)育或脅迫響應有關，其它大多數(shù)基因的功能有待進一步研究。本研究首先分析了水稻CDPKs基因啟動子區(qū)的脅迫響應元件，然后利用RT-PCR和Northern blot雜交技術并結合水稻表達數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，對CDPKs基因在

2、不同脅迫環(huán)境和不同水稻組織中的轉(zhuǎn)錄表達情況進行了分析，根據(jù)表達結果鑒定出脅迫響應基因；選取OsCPK8和OsCPK6基因，利用RNAi抑制基因表達技術和超表達技術對它們的功能進行了分析，分別明確了它們在水稻株高的形態(tài)建成和非生物脅迫響應中的作用。 本研究獲得的主要研究結果如下： 1.水稻 CDPKs 基因的表達分析 (1)通過對CDPKs保守序列的搜索分析，在水稻基因組中鑒定出29個CDPKs基因，它們具有典型的

3、CDPKs結構域，即Ser/The蛋白激酶區(qū)、鈣調(diào)素類似結構域。 (2)29個CDPKs基因啟動子區(qū)域均含有數(shù)量不等的多種調(diào)控脅迫響應的順式元件，暗示這些基因可能與這些脅迫響應有關。這些元件包括ABA響應元件EBOXBNNAPA，光調(diào)控元件 IBOXCORE、脫水響應元件MYBCORE、MYCATRD22、DRECRTCOREAT，低溫響應元件LTRECOREATCOR15，熱激響應元件CCAATBOX和防衛(wèi)反應元件WBOXAT

4、NPR1。 (3)在水稻表達數(shù)據(jù)庫中檢索出11個與水稻CDPKs基因?qū)腅STs，它們對低溫、干旱、高鹽、幾丁質(zhì)激發(fā)子處理和稻瘟病病菌侵染等脅迫表現(xiàn)出廣泛的轉(zhuǎn)錄響應。 (4)根據(jù)水稻CDPKs基因轉(zhuǎn)錄表達的組織特異性，可將水稻CDPKs基因分為7類；新篩選出3個受脅迫誘導發(fā)生表達變化的水稻CDPKs基因，OsCPK6、OsCPK17和OsCPK25，其中OsCPK6受干旱和鹽脅迫誘導轉(zhuǎn)錄表達上升，OsCPK17在低溫、

5、干旱和鹽脅迫刺激下轉(zhuǎn)錄量下降，OsCPK25受熱激誘導轉(zhuǎn)錄量上升。這些脅迫誘導基因在水稻對逆境脅迫的響應中可能起著重要作用。 2.OsCPK8 基因功能分析 (1)運用RNAi技術構建了OsCPK8 基因的抑制表達載體并轉(zhuǎn)化水稻，大部分轉(zhuǎn)基因植株較野生型植株高度降低，植株矮小的原因主要是節(jié)間縮短，倒1、2、3節(jié)間和穗長的變化對植株高度變化的影響最大。 (2)對OsCPK8基因的表達和轉(zhuǎn)基因植株的高度進行共分離檢測

6、，結果表明株高與OsCPK8基因的RNA表達量呈現(xiàn)出共分離，矮化植株中OsCPK8基因的表達受到抑制，轉(zhuǎn)錄量有不同程度的下降。說明OsCPK8基因表達量的下降是植株變矮的原因。 (3)水稻內(nèi)源赤霉素含量測定表明，OsCPK8 RNAi矮化植株內(nèi)源GA<,3>含量顯著低于野生型植株的水平；施用外源赤霉素，矮化植株的株高有一定程度的回復，但不能回復到野生型水平；對幼苗進行赤霉素敏感性分析的結果表明，矮化植株對赤霉素不如野生型敏感。這

7、些結果表明OsCPK8 RNAi矮化植株的赤霉素合成和信號傳遞途徑均可能受到阻礙。 (4)OsCPK8 RNAi矮化植株中赤霉素合成相關基因OsGA2ox1和OsGA2ox2，以及赤霉素信號調(diào)控基因OsGAI的轉(zhuǎn)錄表達發(fā)生了改變，在此基礎上提出了OsCPK8的信號通路假設。 (5)對OsCPK8 RNAi矮化植株進行的細胞學分析表明，矮化植株節(jié)間的伸長區(qū)細胞縱向長度變短，這可能是植株矮化的細胞學基礎。 3.OsC

8、PK6 基因功能分析 (1)利用RT-PCR技術從水稻中分離出OsCPK6基因的全長cDNA片段，根據(jù)其核苷酸序列推測的氨基酸肽鏈包含508個氨基酸，具有典型的鈣依賴的蛋白激酶結構。OsCPK6定位于細胞膜和細胞核。 (2)將OsCPK6全長cDNA片段置于CaMV 35S啟動子的調(diào)控下導入水稻，獲得16個單拷貝轉(zhuǎn)基因植株，RNA水平的表達分析表明，轉(zhuǎn)基因植株中OsCPK6基因轉(zhuǎn)錄量比非轉(zhuǎn)化對照高。 (3)干旱和

9、鹽脅迫試驗表明，3個轉(zhuǎn)OsCPK6基因株系S1、S3和S5在脅迫下的萎蔫苗率明顯低于非轉(zhuǎn)化對照，說明OsCPK6超表達轉(zhuǎn)基因水稻對干旱和鹽脅迫的耐性增強。 (4)對轉(zhuǎn)OsCPK6基因水稻進行生理分析表明，在脅迫環(huán)境下轉(zhuǎn)基因水稻葉片中脯氨酸含量較非轉(zhuǎn)化對照植株高，這可能是轉(zhuǎn)OsCPK6基因水稻抗逆性增強的生理原因。 (5)轉(zhuǎn)基因水稻中OsCPK6的超表達使得脅迫誘導轉(zhuǎn)錄因子基因SNAC1的轉(zhuǎn)錄表達增強，OsCPK6可能通過