水稻OsRINGzf基因的功能研究.pdf

1、水稻是世界上最主要的糧食作物之一，生產(chǎn)消耗水量非常大，這與近年來全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的水資源短缺形成了尖銳的矛盾，因此發(fā)展抗旱的栽培稻被認(rèn)為是節(jié)約水資源的有效手段。根據(jù)抗旱基因作用方式的不同，將抗旱基因分成兩類：一類是功能基因，其編碼產(chǎn)物對(duì)水稻抗旱性直接起保護(hù)作用；一類是調(diào)節(jié)基因，其編碼產(chǎn)物在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)過程中起調(diào)節(jié)功能基因的作用。本研究的目的基因OsRINGzf是基于遺傳定位、生物信息學(xué)和表達(dá)譜分析的分析方法獲得的，在水稻第4染色

2、體QTL區(qū)間，預(yù)測(cè)為E3連接酶。
　　 OsRINGzf基因全長(zhǎng)cDNA序列長(zhǎng)度為1197 bp，其編碼框ORF長(zhǎng)度為564 bp，編碼一個(gè)187個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該序列C端有一個(gè)保守的RING（really interesting new gene）結(jié)構(gòu)域，N端有三個(gè)轉(zhuǎn)膜（TM）區(qū)。預(yù)測(cè)為RING-H2（C3H2C3）型E3連接酶。E3連接酶可以識(shí)別特異蛋白，并通過26S蛋白酶體途徑降解。本研究的主要內(nèi)容：
　　 1．

3、建立超表達(dá)載體、抑制表達(dá)載體、GFP融合表達(dá)載體和啟動(dòng)子：GFP載體，轉(zhuǎn)化水稻和擬南芥，獲得T0代植株。其中，超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的水稻陽性植株已收獲T1代種子。對(duì)水稻轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因材料的相對(duì)發(fā)芽率和平均株高都比對(duì)照中花11低。
　　 2．通過TILLING、測(cè)序等分析方法，對(duì)OsRINGzf基因在野生稻、早稻核心種質(zhì)、珍汕97B和IRAT109中的序列進(jìn)行對(duì)比分析。與RAT109中該基因相比，野生稻中OsRI

4、NGzf基因序列變化可分為5種類型，其中S1061和100916中OsRINGzf基因因?yàn)橐粋€(gè)堿基的插入突變，致使RING結(jié)構(gòu)域發(fā)生變化，可能導(dǎo)致該基因喪失E3連接酶活性；早稻核心種質(zhì)中，凝膠電泳圖顯示有3中不同的序列類型，通過測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，在ORF內(nèi)變化的有兩種類型，其中在ORF變化相同的類型，彼此間在內(nèi)含子序列上有變化。
　　 3．通過RT-PCR分析在正常生長(zhǎng)情況下和旱脅迫處理的情況下，OsRINGzf基因的表達(dá)差異。在I

5、RAT109的苗期、分蘗盛期和孕穗期，分別進(jìn)行干旱脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在苗期和分蘗盛期，OsRINGzf基因的表達(dá)都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在苗期的表達(dá)變化最為明顯。在孕穗期，OsRINGzf基因的表達(dá)開始呈上升趨勢(shì)，但是在4-6天下降，表達(dá)幾乎為0，在脅迫7天的時(shí)候表達(dá)又上升，且表達(dá)量達(dá)到了最大。復(fù)水后，三個(gè)時(shí)期中的OsRINGzf基因表達(dá)都呈下降趨勢(shì)，且低于對(duì)照時(shí)期。在植株正常生長(zhǎng)情況下，轉(zhuǎn)基因植株中OsRINGzf基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照中

6、花11。對(duì)植株進(jìn)行20％PEG6000模擬干旱處理144小時(shí)后，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因植株中，OsRINGzf基因的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，復(fù)水之后OsRINGzf基因的達(dá)量并無太大的變化。部分轉(zhuǎn)基因株系在復(fù)水之后長(zhǎng)勢(shì)好于中花11對(duì)照，顯示了較好的復(fù)原抗旱性。
　　 4．構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-32a+，通過IPTG誘導(dǎo)，從大腸桿菌中提取OsRINGzf基因的表達(dá)蛋白，通過SDS-PAGE電泳，分離獲得了OsRINGzf基因的蛋白，優(yōu)化建