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文檔簡介
1、本研究旨在考察胰高血糖素樣肽-2(Glucagon-like peptide-2,GLP-2)對脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)應(yīng)激的仔豬空腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白基因、蛋白表達(dá)和屏障功能的影響以及GLP-2調(diào)控緊密連接與屏障功能可能的分子機(jī)制(PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑),深入探討GLP-2影響腸道屏障功能的基本規(guī)律以及可能的作用機(jī)理。研究共包括兩個(gè)試驗(yàn)。
試驗(yàn)一、GL
2、P-2對LPS應(yīng)激的IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)及屏障功能的影響
本試驗(yàn)在研究LPS與GLP-2對IPEC-J2細(xì)胞緊密連接和屏障功能的影響基礎(chǔ)上,進(jìn)一步考察了GLP-2對LPS應(yīng)激的IPEC-J2細(xì)胞緊密連接和屏障功能的影響。
試驗(yàn)一采用單因子設(shè)計(jì),分別考察100μg/ml LPS、100nmol/L GLP-2和100μg/mlLPS+100nmol/L GLP-2處理IPEC-J2細(xì)胞24h,對細(xì)胞形態(tài)、緊密
3、連接基因、蛋白表達(dá)和屏障功能的影響,每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。通過研究GLP-2對LPS應(yīng)激IPEC-J2細(xì)胞緊密連接和屏障功能相關(guān)指標(biāo)的影響,初步探討GLP-2對LPS應(yīng)激IPEC-J2細(xì)胞的保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示:
1、與對照組相比,100μg/ml LPS處理可嚴(yán)重破壞細(xì)胞形態(tài)、顯著降低IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P<0.01),降低量分別為46%、57%和3
4、4%;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P<0.01),降低量分別為76.5%、81.7%和78.8%;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P<0.01),降低量為92.4%。
2、與對照組相比,100nmol/L GLP-2處理可有效優(yōu)化細(xì)胞形態(tài)、顯著增加IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mR
5、NA的表達(dá)(P<0.01),增加量分別為148%、261%和54%;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P<0.01),增加量分別為35%、39%和62%;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P<0.01),增加量為27.2%。
3、與100μg/ml LPS處理組相比,在100μg/ml LPS基礎(chǔ)上添加100nmol/LGLP-2可顯著改善
6、細(xì)胞形態(tài)、增加IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P<0.01),增加量分別為46.3%、65.1%和30.3%;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P<0.01),增加量分別為183%、300%和231.8%;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P<0.01),增加量為848.5%。
7、 上述結(jié)果表明,GLP-2不僅能提高正常IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA和蛋白的表達(dá),增強(qiáng)屏障功能,還能顯著抑制由LPS應(yīng)激造成的IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)破壞、緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)下降,維護(hù)細(xì)胞屏障功能。
試驗(yàn)二、GLP-2調(diào)控IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)及屏障功能的分子機(jī)制研究
試驗(yàn)二研究了G
8、LP-2對IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)及屏障功能的影響,并通過添加PI3K特異性抑制劑Wortmannin(Wort)和LY294002(LY)進(jìn)一步探討了GLP-2能否通過PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)及屏障功能。試驗(yàn)共分4個(gè)處理,每個(gè)處理4個(gè)重復(fù),分別為對照組,100nmol/L GLP-2處理組,100nmol/L GLP-2+10nmol/L Wort處理組,100nmol/L GLP
9、-2+10μmol/L LY處理組,其中特異性抑制劑添加組處理前分別用無血清培養(yǎng)液加相應(yīng)抑制劑培養(yǎng)1h??疾熘笜?biāo)包括PI3K-Akt-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá),IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA和蛋白的表達(dá),IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)。研究結(jié)果顯示:
1、與對照組相比,100nmol/LGLP-2處理可顯著增加IPEC-J2
10、細(xì)胞Akt、mTOR以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P<0.01),增加量分別為478%、590%、260%、370%和159%;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞p-Akt、p-mTOR比例以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P<0.01),增加量分別為59.4%、67.3%,35.0%、38.2%和58.3%;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)
11、胞電阻(TER)(P<0.01),增加量為23.5%。
2、與100nmol/LGLP-2處理組相比,100nmol/L GLP-2+10nmol/L Wort處理組可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞Akt、mTOR以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P<0.01),降低量分別為46.9%、50.5%,38.1%、49.6%和18.9%;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞p-Akt、p-mT
12、OR比例以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P<0.01),降低量分別為15.5%、15.4%,10.8%、14.2%和27.6%;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P<0.01),降低量為5.4%。
3、與100nmol/L GLP-2處理組相比,100nmol/L GLP-2+10μmol/L LY處理組可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞Akt、mTOR以及緊密連接相
13、關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1mRNA的表達(dá)(P<0.01),降低量分別為67.2%、70.8%,49.6%、60.9%和25.8%;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞p-Akt、p-mTOR比例以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P<0.01),降低量分別為24.2%、22.5%,13.7%、16.3%和31.9%;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P<0.
14、01),降低量為10.3%。
結(jié)果表明,PI3K特異性抑制劑Wortmannin(Wort)和LY294002(LY)能夠下調(diào)PI3K下游相關(guān)激酶Akt和mTOR的表達(dá)量,能顯著抑制GLP-2對IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)和屏障功能的提高與增強(qiáng)。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)LPS應(yīng)激顯著下調(diào)了IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá),破壞了IPEC-J2細(xì)胞屏障功能,添加GLP-2能夠?qū)PS應(yīng)激的IPEC-J2細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。
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