胰高血糖素樣肽--2對(duì)IPEC--J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)與屏障功能的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、本研究旨在考察胰高血糖素樣肽-2(Glucagon-like peptide-2，GLP-2)對(duì)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）應(yīng)激的仔豬空腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白基因、蛋白表達(dá)和屏障功能的影響以及GLP-2調(diào)控緊密連接與屏障功能可能的分子機(jī)制(PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑)，深入探討GLP-2影響腸道屏障功能的基本規(guī)律以及可能的作用機(jī)理。研究共包括兩個(gè)試驗(yàn)。
　　試驗(yàn)一、GL

2、P-2對(duì)LPS應(yīng)激的IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)及屏障功能的影響
　　本試驗(yàn)在研究LPS與GLP-2對(duì)IPEC-J2細(xì)胞緊密連接和屏障功能的影響基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了GLP-2對(duì)LPS應(yīng)激的IPEC-J2細(xì)胞緊密連接和屏障功能的影響。
　　試驗(yàn)一采用單因子設(shè)計(jì)，分別考察100μg/ml LPS、100nmol/L GLP-2和100μg/mlLPS+100nmol/L GLP-2處理IPEC-J2細(xì)胞24h，對(duì)細(xì)胞形態(tài)、緊密

3、連接基因、蛋白表達(dá)和屏障功能的影響，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。通過研究GLP-2對(duì)LPS應(yīng)激IPEC-J2細(xì)胞緊密連接和屏障功能相關(guān)指標(biāo)的影響，初步探討GLP-2對(duì)LPS應(yīng)激IPEC-J2細(xì)胞的保護(hù)作用。研究結(jié)果顯示:
　　1、與對(duì)照組相比，100μg/ml LPS處理可嚴(yán)重破壞細(xì)胞形態(tài)、顯著降低IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，降低量分別為46％、57％和3

4、4％;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，降低量分別為76.5％、81.7％和78.8％;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P＜0.01)，降低量為92.4％。
　　2、與對(duì)照組相比，100nmol/L GLP-2處理可有效優(yōu)化細(xì)胞形態(tài)、顯著增加IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mR

5、NA的表達(dá)(P＜0.01)，增加量分別為148％、261％和54％;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，增加量分別為35％、39％和62％;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P＜0.01)，增加量為27.2％。
　　3、與100μg/ml LPS處理組相比，在100μg/ml LPS基礎(chǔ)上添加100nmol/LGLP-2可顯著改善

6、細(xì)胞形態(tài)、增加IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，增加量分別為46.3％、65.1％和30.3％;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，增加量分別為183％、300％和231.8％;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P＜0.01)，增加量為848.5％。

7、　　上述結(jié)果表明，GLP-2不僅能提高正常IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)屏障功能，還能顯著抑制由LPS應(yīng)激造成的IPEC-J2細(xì)胞形態(tài)破壞、緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)下降，維護(hù)細(xì)胞屏障功能。
　　試驗(yàn)二、GLP-2調(diào)控IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)及屏障功能的分子機(jī)制研究
　　試驗(yàn)二研究了G

8、LP-2對(duì)IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)及屏障功能的影響，并通過添加PI3K特異性抑制劑Wortmannin(Wort)和LY294002(LY)進(jìn)一步探討了GLP-2能否通過PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)及屏障功能。試驗(yàn)共分4個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，分別為對(duì)照組，100nmol/L GLP-2處理組，100nmol/L GLP-2+10nmol/L Wort處理組，100nmol/L GLP

9、-2+10μmol/L LY處理組，其中特異性抑制劑添加組處理前分別用無血清培養(yǎng)液加相應(yīng)抑制劑培養(yǎng)1h。考察指標(biāo)包括PI3K-Akt-mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)，IPEC-J2細(xì)胞緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)。研究結(jié)果顯示:
　　1、與對(duì)照組相比，100nmol/LGLP-2處理可顯著增加IPEC-J2

10、細(xì)胞Akt、mTOR以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，增加量分別為478％、590％、260％、370％和159％;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞p-Akt、p-mTOR比例以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，增加量分別為59.4％、67.3％，35.0％、38.2％和58.3％;可顯著增加IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)

11、胞電阻(TER)(P＜0.01)，增加量為23.5％。
　　2、與100nmol/LGLP-2處理組相比，100nmol/L GLP-2+10nmol/L Wort處理組可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞Akt、mTOR以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，降低量分別為46.9％、50.5％，38.1％、49.6％和18.9％;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞p-Akt、p-mT

12、OR比例以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，降低量分別為15.5％、15.4％，10.8％、14.2％和27.6％;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P＜0.01)，降低量為5.4％。
　　3、與100nmol/L GLP-2處理組相比，100nmol/L GLP-2+10μmol/L LY處理組可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞Akt、mTOR以及緊密連接相

13、關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1mRNA的表達(dá)(P＜0.01)，降低量分別為67.2％、70.8％，49.6％、60.9％和25.8％;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞p-Akt、p-mTOR比例以及緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1蛋白的表達(dá)(P＜0.01)，降低量分別為24.2％、22.5％，13.7％、16.3％和31.9％;可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞跨上皮細(xì)胞電阻(TER)(P＜0.

14、01)，降低量為10.3％。
　　結(jié)果表明，PI3K特異性抑制劑Wortmannin(Wort)和LY294002(LY)能夠下調(diào)PI3K下游相關(guān)激酶Akt和mTOR的表達(dá)量，能顯著抑制GLP-2對(duì)IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)和屏障功能的提高與增強(qiáng)。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LPS應(yīng)激顯著下調(diào)了IPEC-J2細(xì)胞緊密連接表達(dá)，破壞了IPEC-J2細(xì)胞屏障功能，添加GLP-2能夠?qū)PS應(yīng)激的IPEC-J2細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。