清胃理腸膠囊對實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響.pdf

1、研究背景:
　　潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種局限在直腸、結(jié)腸粘膜及粘膜下層的慢性、非特異性、炎癥性腸道疾病，以粘膜慢性炎癥和潰瘍形成為主要病理特點(diǎn)，主要臨床表現(xiàn)有腹痛、腹瀉、粘液膿血便、里急后重等。該病以易于復(fù)發(fā)、纏綿難愈，長期消耗患者體質(zhì)，降低其生活質(zhì)量，而受到醫(yī)務(wù)工作者的廣泛關(guān)注，被公認(rèn)為醫(yī)學(xué)界的疑難病之一。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中UC的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確。
　　西醫(yī)治療UC以內(nèi)科用藥為主，傳統(tǒng)藥物有:
　?、兕惞檀碱惣?/p>

2、素，代表性藥物有氫化可的松、潑尼松；
　　②氨基水楊酸類抗炎藥物，常用藥如柳氮磺胺吡啶（SASP）。對于激素及抗炎藥物無效的頑固病例或嚴(yán)重病例，會(huì)考慮應(yīng)用；
　?、勖庖咭种苿?，主要有硫唑嘌呤（AZA）、羥基嘌呤（6MP）、環(huán)孢素（CYA）和甲氨蝶呤（MTX）。這些藥物的作用重點(diǎn)在于緩解UC的急性發(fā)作，而對于慢性持續(xù)期的治療及其反復(fù)發(fā)作、遷延難愈的特性則收效甚微。并且這三類藥物都存在不同程度不同方面的不良反應(yīng)。近年來又出現(xiàn)了從

3、UC的免疫發(fā)病機(jī)制出發(fā)，針對炎癥發(fā)生過程的重要步驟進(jìn)行抗細(xì)胞治療的生物學(xué)療法，較成熟的有抗TNF單克隆抗體，但還沒有明確、統(tǒng)一的療效報(bào)道。
　　潰瘍性結(jié)腸炎根據(jù)其臨床表現(xiàn)，相當(dāng)于中醫(yī)理論中的“痢疾”，初則為實(shí)證，治療不當(dāng)或不及時(shí)，遷延反復(fù)，久則成正虛邪戀，虛實(shí)夾雜之虛性痢疾。中醫(yī)認(rèn)為痢疾的病因是外感時(shí)邪或內(nèi)傷飲食：濕熱或疫毒侵及腸胃，阻滯氣血，相互搏結(jié)，腐化血肉而成痢；飲食不潔或不節(jié)，滯礙腸胃氣機(jī)，釀濕生熱，煎灼氣血而成痢。在辨證

4、論治時(shí)，按病因病機(jī)及臨床表現(xiàn)將痢疾劃分為濕熱痢、疫毒痢、寒濕痢以及陰虛痢、虛寒痢和休息痢。各個(gè)證型因其病機(jī)不同而治法方藥各異，濕熱痢需清熱解毒，行氣活血，方以芍藥湯為主；疫毒痢需清熱涼血解毒，方以芍藥湯為主；寒濕痢需溫化寒濕，方以胃苓湯為主；陰虛痢需養(yǎng)陰清腸，方以駐車丸為主；虛寒痢需溫補(bǔ)脾腎，澀腸固脫，方以桃花湯或真人養(yǎng)臟湯為主；休息痢需溫中清腸，調(diào)氣化滯，方以連理湯為主。后人對于痢疾治療的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)是：熱痢清之，寒痢溫之，初痢實(shí)則通之，

5、久痢虛則補(bǔ)之。寒熱交錯(cuò)者，清溫并用，虛實(shí)夾雜者，通澀兼施。
　　清胃理腸膠囊方組為枳實(shí)、厚樸、陳皮、半夏、大腹皮、萊菔子、梔子、延胡索、生甘草，秉承初痢實(shí)則通之的原則，主要針對濕熱痢初起多實(shí)證而設(shè)。枳實(shí)、厚樸消積通滯，陳皮、半夏燥濕健胃，大腹皮、萊菔子行氣除脹，梔子清熱，延胡索調(diào)氣行血止痛，生甘草調(diào)和諸藥，共同達(dá)成清熱利濕，行氣活血，治療濕熱痢初起實(shí)證的效果。該藥至今已應(yīng)用于臨床8年，對于相應(yīng)證型的痢疾即潰瘍性結(jié)腸炎有肯定的療效。

6、但還未通過實(shí)驗(yàn)室研究探討過其起效機(jī)制，因此我在碩士就讀期間，以研究清胃理腸膠囊的起效機(jī)制，使其能揚(yáng)長避短，發(fā)揮最大的臨床效用為宗旨，開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。
　　研究目的:
　　1、觀察潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸粘膜的病理變化，以及清胃理腸膠囊對病變粘膜的修復(fù)作用。
　　2、研究T淋巴細(xì)胞亞群CD4+、CD8+百分率和CD4+/CD8+和潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生的關(guān)系，以及清胃理腸膠囊對CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的影響。

7、>　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、UC動(dòng)物模型制造及分組：普通級SD大鼠62只，體重180g-220g。隨機(jī)分為正常組12只和造模組50只。造模組大鼠頸背部剃毛，每天以20g/L的2,4-二硝基氯苯丙酮液滴背1次,每次每鼠0.3ml,連續(xù)14d,第15天用直徑2mm硅膠管經(jīng)肛門插入結(jié)腸8cm處,注入0.04mmol/L的2,4-二硝基氯苯乙醇液0.25ml,第16天同部位注入80ml/L醋酸溶液2ml,準(zhǔn)確計(jì)時(shí)15s后用0.85％氯化鈉5

8、ml沖洗。造模結(jié)束次日，觀察大鼠一般狀況及糞便形態(tài)。并隨機(jī)抽取正常組及造模組各2只大鼠處死，分離肛門上7～9cm處的結(jié)腸粘膜，肉眼觀察比較其形態(tài)區(qū)別，并取部分結(jié)腸10％甲醛固定，做病理切片檢查，判斷造模是否成功。余造模組48只大鼠隨機(jī)分為模型對照組、清胃理腸膠囊組、西藥柳氮磺吡啶(SASP)組，每組16只。
　　2、給藥方式：造模結(jié)束次日灌胃給藥。清胃理腸膠囊棄膠囊殼，用蒸餾水將藥粉配置成100mg/ml的混懸液。柳氮磺胺吡啶片(

9、SASP)粉碎，用蒸餾水配置成50mg/ml的混懸液,根據(jù)人和動(dòng)物用藥劑量換算公式，即大鼠用藥劑量=6.25×人的用藥劑量。大鼠稱重，取約值，清胃理腸膠囊組按3ml/只給藥，SASP組按2ml/只給藥。正常組和模型對照組給予生理鹽水。每日一次灌胃給藥，共持續(xù)20天。
　　3、觀察指標(biāo)：
　　①觀察造模過程中及給藥前后各組大鼠的一般情況。
　?、赥淋巴細(xì)胞亞群檢測：給藥結(jié)束次日，2％戊巴比妥鈉(3ml/Kg)麻醉大鼠，心

10、臟取血100ul置入肝素鈉真空抗凝采血管，加CD4、CD8單克隆抗體各20ul；混勻避光孵育30分鐘，加溶血素0.5ml混勻，10分鐘后1500r/min，離心5min，去上清，加pbs500ul上機(jī)檢測。
　?、鄄±頇z查：取血后，剖腹取肛門以上6-9cm處腸段，沿腸系膜縱軸剪開，冰生理鹽水洗凈；粘膜向上平鋪，觀察病理改變。然后剪取部分結(jié)腸，10％甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察病理變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　

11、1、一般情況：造模后3天內(nèi)大鼠精神萎靡，迅速消瘦，皮毛稀疏，出現(xiàn)膿血便。個(gè)別出現(xiàn)腹部鼓脹，該類大鼠都在2-3天內(nèi)死亡。模型對照組死亡3只，清胃理腸膠囊組死亡1只，SASP組死亡2只。
　　2、病理改變：
　　①大體病理改變：正常大鼠結(jié)腸粘膜完整，薄而光滑，有一定透明度。造模后大鼠結(jié)腸粘膜普遍水腫、糜爛、潰瘍、附著偽膜，并覆蓋有連結(jié)成片的膿苔。
　　②組織病理改變：正常組粘膜上皮結(jié)構(gòu)完整，固有層腺體排列整齊密集。造模后粘

12、膜上皮細(xì)胞廣泛脫落，血管壁增厚，組織水腫，大量炎細(xì)胞浸潤，潰瘍?nèi)诤铣善[窩消失。經(jīng)治療，清胃理腸膠囊組大鼠結(jié)腸接近正常，上皮結(jié)構(gòu)完整，充血消失，有少量炎細(xì)胞浸潤。SASP組仍有輕度水腫。
　　3、T淋巴細(xì)胞亞群：模型組與正常組比較CD4+、CD8+下降明顯，CD4+/CD8+升高，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）；清胃理腸膠囊組和SASP組經(jīng)治療后，與模型組比較，均顯示CD4+、CD8+水平升高，CD4+/CD8+降低，差異有統(tǒng)

13、計(jì)意義（P<0.05）；清胃理腸膠囊組指標(biāo)接近正常對照組，兩組之間無顯著差異（P>0.05），其作用優(yōu)于SASP組（P<0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、清胃理腸膠囊對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸粘膜有明顯修復(fù)作用。
　　2、清胃理腸膠囊可提升外周血CD4+、CD8+百分率，降低CD4+/CD8+水平，具有免疫調(diào)節(jié)作用。
　　本研究以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)形式探討了清胃理腸膠囊對潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制，證實(shí)該藥對UC大鼠的病變結(jié)腸有明