硫黃熏蒸對(duì)白芷化學(xué)成分、藥效和安全性影響的研究.pdf

1、白芷來源為傘形科植物白芷Angelica dahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch. ex Hoffm.) Benth. et Hook. f. var. formosana(Boiss) Shan et Yuan的干燥根，是一味常用中藥。白芷主產(chǎn)于我國四川、河北、安徽、河南等省，一直以來，白芷的產(chǎn)地加工是一個(gè)突出的生產(chǎn)難題。白芷采收

2、后若不及時(shí)干燥，極易腐爛變質(zhì)，目前全國各地的白芷產(chǎn)地加工均采用硫黃熏蒸。硫黃熏蒸雖對(duì)不易干燥或易發(fā)霉、變質(zhì)、生蟲的中藥材具有殺菌防腐、漂白、增加色澤美感等作用，但大量研究表明，熏硫造成中藥材性味劣變，生物活性組分損失及有害物質(zhì)殘留，硫黃熏蒸對(duì)藥材質(zhì)量帶來的負(fù)面影響已引起人們的高度關(guān)注。本文針對(duì)硫黃熏蒸前后及不同熏硫程度對(duì)白芷藥材化學(xué)成分、藥效和安全性的影響，二氧化硫殘留量的變化規(guī)律及熏硫加工的規(guī)范化問題，在前期研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用多學(xué)科的

3、技術(shù)方法，通過系統(tǒng)深入的研究，為白芷硫黃熏蒸加工方法的合理性、規(guī)范化及制定科學(xué)合理、客觀可控的有效成分和外源性有害物質(zhì)二氧化硫殘留量的限量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果如下：
　　1.不同熏硫程度白芷的加工及藥材外觀性狀對(duì)比分析
　　根據(jù)前期白芷主產(chǎn)區(qū)調(diào)研，進(jìn)行了不同硫黃用量、不同熏蒸時(shí)間的加工試驗(yàn)，用產(chǎn)區(qū)傳統(tǒng)搭灶的方式共制備不同熏硫程度白芷樣品21個(gè)，為本文研究的順利進(jìn)行提供了保障。通過對(duì)不同熏硫程度白芷外觀性狀的對(duì)比觀察，發(fā)

4、現(xiàn)熏硫與未熏硫白芷的主要區(qū)別在顏色、斷面特征、氣味等方面。硫黃熏蒸后的白芷表面顏色稍淺，斷面類白色，粉性較強(qiáng)，形成層環(huán)和油點(diǎn)不甚明顯，略帶酸味，但不同熏硫程度的白芷上述特征存在一定差異，隨著硫黃用量和熏蒸時(shí)間的增加，斷面顏色逐漸變白，形成層環(huán)及棕色油點(diǎn)等特征逐漸消失。硫黃熏蒸對(duì)白芷的外觀性狀產(chǎn)生了一定的影響。從白芷的外觀性狀上，可以直觀的判斷白芷是否熏硫以及估計(jì)其硫黃熏蒸的程度。
　　2.首次進(jìn)行了不同熏硫程度白芷二氧化硫殘留量的

5、動(dòng)態(tài)檢測
　　按照《中國藥典》2010版附錄項(xiàng)下的方法對(duì)不同熏硫程度白芷的二氧化硫殘留量進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測。硫黃熏蒸過的樣品二氧化硫殘留量是自然曬干的樣品的幾百甚至上千倍，硫黃用量為25g、100g、200g/10kg藥材和熏蒸時(shí)間為18h的樣品其二氧化硫殘留量符合國家規(guī)定的150mg/kg的限量標(biāo)準(zhǔn)。本研究為白芷硫黃熏蒸加工中熏硫程度的確定提供了參考依據(jù)。硫黃用量和硫黃熏蒸時(shí)間與二氧化硫殘留量雖未呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，但從總體上，隨

6、著硫黃用量的增加和熏蒸時(shí)間的延長，二氧化硫殘留量也有所增加。
　　3.對(duì)不同熏硫程度白芷的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的對(duì)比分析
　　在薄層色譜鑒別方面，確立以氯仿-乙酸乙酯（10:1）和環(huán)己烷-氯仿-乙醚（4:1:2）進(jìn)行二次展開的色譜條件，對(duì)22批不同程度硫黃熏蒸白芷及未熏硫白芷樣品進(jìn)行薄層色譜對(duì)比。氧化前胡素是白芷熏硫與否的一個(gè)指標(biāo)性成分，從薄層色譜圖上可較為直觀的鑒別白芷是否熏硫。
　　在高效液相指紋圖譜分析方面，建立2

7、2批不同程度硫黃熏蒸白芷 HPLC指紋圖譜，校正后得到的對(duì)照色譜中19個(gè)共有峰，其中確認(rèn)了11個(gè)化合物。由于硫黃熏蒸程度的不同，在共有峰的峰面積上有差異。對(duì)比熏硫與未熏硫白芷的圖譜，發(fā)現(xiàn)兩者在色譜峰數(shù)量及峰面積上有差異。通過統(tǒng)計(jì)分析，未熏硫白芷與熏硫白芷聚為兩類，主成分分析綜合評(píng)分熏硫白芷得分較低，質(zhì)量較差。從HPLC指紋圖譜上也能直觀的判斷出白芷熏硫與否。
　　首次進(jìn)行不同熏硫程度白芷LC-MS分析，建立不同熏硫程度白芷的藥材、

8、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的LC-MS分析方法，得到白芷香豆素類化合物不同的變化規(guī)律。三個(gè)不同的極性部位，硫黃熏蒸對(duì)石油醚、乙酸乙酯部位的影響與對(duì)藥材的影響類似，對(duì)正丁醇部位的影響較大，新增加的峰多而明顯。
　　首次進(jìn)行不同程度硫黃熏蒸白芷GC-MS分析，在前期的研究基礎(chǔ)上，建立了不同程度硫黃熏蒸白芷揮發(fā)油的GC-MS分析方法。不同程度硫黃熏蒸白芷的揮發(fā)油中共鑒定出67種化合物。其中有4種共有成分，分別為：2,6-二叔丁

9、基對(duì)甲基苯酚，棕櫚酸乙酯，亞油酸乙酯，十六碳烷基十四烷酸酯。隨著硫黃熏蒸程度的不同，白芷中揮發(fā)油的種類也發(fā)生了變化，產(chǎn)生了很多新的化合物，四個(gè)共有成分變化不一。
　　對(duì)不同熏硫程度白芷的浸出物和指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定，隨著硫黃用量和熏蒸時(shí)間的增加，，白芷的浸出物含量比未熏硫白芷下降28.5％~47.3%，氧化前胡素和歐前胡素的含量總體呈下降趨勢。自然曬干樣品的浸出物、氧化前胡素、歐前胡素含量明顯高于其他經(jīng)過硫黃熏蒸的樣品。

10、　　4.首次對(duì)熏硫與未熏硫白芷的進(jìn)行體內(nèi)血漿的HPLC圖譜對(duì)比研究
　　通過采血時(shí)間、采血部位、給藥劑量等方面的考察，建立了白芷血漿HPLC分析方法，對(duì)比了熏硫與未熏硫白芷體內(nèi)血漿的HPLC圖譜。未熏硫白芷給藥后的血漿HPLC圖譜中出現(xiàn)了12個(gè)色譜峰，其中有2個(gè)峰可能是代謝產(chǎn)生的峰。熏硫白芷入血成分較未熏硫白芷少，入血成分峰面積、總峰面積較低，并且尚未出現(xiàn)代謝產(chǎn)生的峰。本研究為白芷藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　5.首次

11、采用藥效學(xué)結(jié)合血漿藥物化學(xué)的方法對(duì)熏硫與未熏硫白芷進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)
　　分別采用經(jīng)典的二甲苯致小鼠耳腫脹和醋酸致小鼠扭體法對(duì)硫黃熏蒸前后白芷進(jìn)行抗炎、鎮(zhèn)痛的實(shí)驗(yàn)。在藥效學(xué)指標(biāo)上未熏硫白芷高劑量表現(xiàn)出顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，而熏硫白芷部分劑量組顯示出抗炎鎮(zhèn)痛作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各個(gè)劑量組的血漿成分類似但也有所不同。隨著給藥劑量的減小，各劑量組入血成分的峰面積也相應(yīng)減小。推測水合氧化前胡內(nèi)酯可能是白芷鎮(zhèn)痛、抗炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為闡明白芷的

12、譜效關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　6.進(jìn)行了熏硫與未熏硫白芷急性毒性試驗(yàn)
　　通過對(duì)熏硫與未熏硫白芷的急性毒性試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)其安全性。結(jié)果表明，單次灌胃給藥未熏硫白芷LD50為52.41 g生藥/kg，即約相當(dāng)于臨床用量的353倍；單次灌胃給予硫黃熏蒸白芷的最大耐受量為123.6g生藥/kg，即約相當(dāng)于臨床用量的832倍。雖然兩者均在安全使用的范圍，可以安全使用，但是未熏硫白芷的毒性明顯比硫黃熏蒸白芷的毒性大。
　　7.首次進(jìn)行

13、了不同熏硫程度白芷化學(xué)成分、藥效及安全性的相關(guān)性分析
　　用曲線回歸的方法探討了二氧化硫殘留量分別與氧化前胡素、歐前胡素的關(guān)系，建立了二者的模型方程，相關(guān)性良好。氧化前胡素與二氧化硫殘留量二者呈對(duì)數(shù)相關(guān)為Y=0.085-0.011lnX；歐前胡素與二氧化硫殘留量二者呈三次方相關(guān)，關(guān)系式為Y=0.176+3.150×10-7X2-1.666×10-10 X3。
　　探討了白芷抗炎、鎮(zhèn)痛的譜效關(guān)系，用經(jīng)典的二甲苯致小鼠耳腫脹法、

14、醋酸致小鼠扭體法評(píng)價(jià)熏硫與未熏硫的白芷得到的藥效數(shù)據(jù)，與各劑量組的血漿 HPLC指紋圖譜色譜峰峰面積進(jìn)行多元相關(guān)分析。將各劑量組的色譜峰峰面積進(jìn)行主成分分析，求得各組的綜合評(píng)分后，用綜合評(píng)分C作為自變量，藥效學(xué)指標(biāo)作為因變量 Y做曲線回歸，預(yù)測二者的關(guān)系，建立相關(guān)方程。綜合抗炎、鎮(zhèn)痛兩個(gè)藥理譜效關(guān)系結(jié)果，血漿主成分分析的綜合評(píng)分與抗炎、鎮(zhèn)痛的藥效學(xué)指標(biāo)呈正相關(guān)。
　　根據(jù)熏硫與未熏硫白芷急性毒性結(jié)果，結(jié)合白芷體外、體內(nèi)化學(xué)成分分析

15、，推斷引起白芷毒性的可能是與有效成分相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)，至于是白芷中的原型成分還是代謝產(chǎn)物引起的毒性還需要進(jìn)一步的研究。雖然熏硫白芷的毒性較未熏硫白芷低，但外源性有害物質(zhì)二氧化硫殘留量明顯增加，影響用藥的安全性，故應(yīng)規(guī)范白芷硫黃熏蒸的加工方法。
　　8.通過本文研究，為闡明白芷硫黃熏蒸加工方法的合理性、確定合適的熏硫程度以及制定科學(xué)合理、客觀可控的有效成分及二氧化硫限量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)
　　研究發(fā)現(xiàn)，白芷熏硫后雖然影響有效成