氯化血紅素誘導(dǎo)的血紅素加氧酶-1在膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮中的作用.pdf

1、[研究目的]
　　肌萎縮是膿毒癥患者遠(yuǎn)期和嚴(yán)重并發(fā)癥之一，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。膿毒癥導(dǎo)致肌纖維蛋白分解加速是肌萎縮發(fā)生的重要原因。泛素/蛋白酶體系統(tǒng)活性升高，促炎細(xì)胞因子高表達(dá)和氧化應(yīng)激損傷等是膿毒癥時肌纖維降解加速的主要原因。氯化血紅素(hemin)可誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1(HO-1)表達(dá)升高。HO-1具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用，但其對膿毒癥相關(guān)肌萎縮是否有保護(hù)作用尚無報(bào)道。本文首先通過觀察膿毒癥小鼠后肢肌肉萎縮程度及病理學(xué)

2、改變，研究hemin是否對膿毒癥相關(guān)肌萎縮具有保護(hù)作用;其次，通過測定小鼠外周血促炎細(xì)胞因子、骨骼肌HO-1及肌萎縮相關(guān)分子表達(dá)水平等，探究hemin在膿毒癥相關(guān)肌萎縮中的可能作用機(jī)制。
　　[研究方法]
　　1、建立小鼠盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)膿毒癥模型，并按不同處理方式分為四組:假手術(shù)組、CLP組、hemin組及鋅原卟啉(ZnPP，HO-1抑制劑)組。其中，假手術(shù)組及CLP組小鼠予以腹腔注射2％ DMSO水溶液200μl處

3、理;hemin組小鼠予以腹腔注射hemin(50mg/kg)200μl; ZnPP組腹腔注射hemin(50mg/kg)和ZnPP(20mg/kg)共200μl。其中，假手術(shù)組小鼠僅探查腸管未結(jié)扎穿孔。各組小鼠給藥時間為術(shù)前5d、3d、1d。此實(shí)驗(yàn)手術(shù)及取材前小鼠均在2％～3％七氟烷全麻后進(jìn)行。
　　2、術(shù)后3d取各組小鼠后肢，分離皮膚后大體觀察骨骼肌形態(tài);手術(shù)當(dāng)日及術(shù)后1d、3d、5d和7d時，分離小鼠比目魚肌并稱量肌肉濕重，初

4、步判斷各組小鼠骨骼肌萎縮程度及變化。
　　3、術(shù)后24h利用酪氨酸測定法，測定各組小鼠比目魚肌降解后釋放的酪氨酸濃度，以分析骨骼肌蛋白降解程度。
　　4、術(shù)后5d取小鼠脛骨前肌，使用4％多聚甲醛固定并作石蠟切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并計(jì)算各組小鼠骨骼肌纖維橫截面積變化。
　　5、分別于術(shù)后1d、4d和7d時分離小鼠脛骨前肌，采用實(shí)時定量PCR法(RT-PCR)測定骨骼肌組織HO-1的mRNA表達(dá)水平;術(shù)后1d取小鼠脛骨前

5、肌，使用Western蛋白印記方法(Western-blotting)測定骨骼肌HO-1蛋白表達(dá)水平;術(shù)后24h測定小鼠脛骨前肌膽紅素水平，以評估HO-1活性。
　　6、術(shù)后24h時經(jīng)小鼠心臟取血，使用血漿酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定各組小鼠外周血IL-6及TNF-α濃度。
　　7、分別于術(shù)后1d、4d和7d時采用RT-PCR法測定小鼠脛骨前肌萎縮相關(guān)基因-1(atrogin-1)和肌肉環(huán)狀指分子1(MuRF1)的mRN

6、A表達(dá)水平;術(shù)后1d使用Western-Blot法測定脛骨前肌atrogin-1和MuRF1的蛋白表達(dá)水平。
　　8、術(shù)后24h在全麻下迅速分離小鼠脛骨前肌，液氮凍存。使用分光光度計(jì)法測定肌組織丙二醛(malonaldehyde，MDA)濃度和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，分析各組小鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷程度。
　　[結(jié)果]
　　1、術(shù)后3d CLP組小鼠后肢較假手術(shù)組顯著變細(xì)，

7、hemin組較CLP組有所改善;ZnPP組小鼠后肢與CLP組相似，均發(fā)生較顯著的肌萎縮現(xiàn)象。假手術(shù)組小鼠在術(shù)后0d～7d內(nèi)比目魚肌重量無顯著改變，CLP組比目魚肌重量呈顯著下降，hemin組比目魚肌重量也呈下降趨勢，然較CLP組下降程度減慢，術(shù)后3d、5d和7d時與CLP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ZnPP組與CLP組小鼠比目魚肌重量下降差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2、使用酪氨酸測定法檢測肌肉分解所釋放的酪氨酸濃度，結(jié)果顯示CLP組酪氨酸

8、濃度高于假手術(shù)組近2倍，hemin組酪氨酸濃度較CLP組低，ZnPP組酪氨酸濃度高于假手術(shù)組和hemin組，但與CLP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠脛骨前肌橫截面，發(fā)現(xiàn)CLP組和ZnPP組肌纖維較假手術(shù)組顯著變細(xì)，hemin組肌纖維較CLP組改善。計(jì)算各組肌纖維橫截面積，結(jié)果顯示CLP組較假手術(shù)組顯著縮小，hemin組肌纖維面積較CLP組增大，ZnPP組橫截面積較hemin組減小，與CLP組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義。
　　4、各組小鼠外周血ELISA結(jié)果顯示，術(shù)后24h CLP組小鼠IL-6及TNF-α水平顯著高于假手術(shù)組，hemin組IL-6及TNF-α水平低于CLP組，ZnPP組上述兩種炎性因子表達(dá)水平與CLP組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、RT-PCR結(jié)果顯示，術(shù)后1d、4d和7d時hemin組和ZnPP組骨骼肌HO-1 mRNA表達(dá)水平均高于假手術(shù)組和CLP組，但HO-1表達(dá)整體呈下降趨勢。 Hemin組骨骼肌atrogin

10、-1和MuRF1表達(dá)水平均顯著低于CLP組。通過測定膽紅素濃度分析HO-1活性，發(fā)現(xiàn)術(shù)后24h hemin組肌肉HO-1活性高于CLP組，但ZnPP組HO-1活性顯著低于hemin組。
　　6、Western-blotting結(jié)果顯示，CLP組小鼠骨骼肌組織HO-1蛋白表達(dá)略高于假手術(shù)組，hemin組和ZnPP組HO-1表達(dá)顯著高于假手術(shù)組和CLP組。CLP組肌組織atrogin-1和MuRF1蛋白表達(dá)均顯著高于假手術(shù)組，hemi

11、n組兩者表達(dá)均低于CLP組，ZnPP組atrogin-1和MuRF1均為高表達(dá)。
　　7、CLP組小鼠脛骨前肌MDA濃度顯著高于假手術(shù)組，hemin組MDA濃度低于CLP組，ZnPP組MDA濃度與CLP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SOD活性測定顯示hemin組小鼠骨骼肌組織SOD活性高于CLP組，ZnPP組SOD活性與CLP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　[結(jié)論]
　　Hemin可減輕膿毒癥小鼠骨骼肌萎縮程度，其機(jī)制可能與h