乳酸菌重組血紅素加氧酶-1對腸道的保護(hù)作用.pdf

1、臨床上多種原因尤其是休克和內(nèi)毒素血癥可以導(dǎo)致腸粘膜屏障功能下降，腸腔內(nèi)大量細(xì)菌或內(nèi)毒素向腸腔外遷移，即發(fā)生內(nèi)毒素和細(xì)菌移位(bacterial translocation，BT)，繼而導(dǎo)致多種炎癥介質(zhì)的過度釋放，成為系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(system innammatory responsesyndrome，SIRS)和多器官功能不全綜合征(multiple organdysfunction syndrome，MODS)的“發(fā)動機(jī)”。所

2、以，如何保護(hù)腸粘膜屏障功能成為當(dāng)前研究的一項(xiàng)重要課題。 益生菌(probiotics)是指能在生物體內(nèi)存活，對生物體的健康有益的一類微生物。近年研究表明，益生菌能夠糾正腸道微生態(tài)失衡，維持腸道屏障功能和減少內(nèi)源性感染。然而，單一應(yīng)用益生菌尚不足以防止嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等所致的腸粘膜屏障功能的破壞。血紅素加氧酶(heme oxygenase)是血紅素分解代謝的限速酶，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)3種同工酶：HO-1、HO-2和HO-3，其中只有HO

3、-1是誘導(dǎo)型酶，而腸道HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)對于其屏障功能具有顯著的保護(hù)作用。 因此，本研究克隆大鼠HO-1基因；以人類腸道有益菌群乳酸乳球菌為載體，構(gòu)建能夠表達(dá)具有生物活性HO-1的重組乳酸乳球菌(1actococcus lactis)；然后觀察重組乳酸乳球菌對失血性休克和內(nèi)毒素血癥大鼠腸道屏障的保護(hù)效果，從而為保護(hù)腸粘膜屏障功能提供新思路。 第一部分大鼠血紅素加氧酶-1基因在乳酸乳球菌中的表達(dá) 目的：在乳酸乳球菌

4、中表達(dá)大鼠血紅素加氧酶-1基因。 方法：采用RT-PCR技術(shù)從大鼠脾總RNA中分離擴(kuò)增血紅素加氧酶HO-1基因，將該基因克隆進(jìn)pGEM-T easy質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a提取質(zhì)粒，鑒定HO-1基因。酶切后與pSEC質(zhì)粒連接，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000中，轉(zhuǎn)化子在含有氯霉素的腦心浸液培養(yǎng)基上培養(yǎng)。用乳鏈菌肽誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，SDS-PAGE、Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，并采用分光光度法測定HO

5、-1活性。 結(jié)果：表達(dá)產(chǎn)物相對分子量約為32 KD，表達(dá)量約為7.0 mg/L，HO-1活性為2.386 units/mg/h。 結(jié)論：乳酸乳球菌能夠表達(dá)具有生物活性的大鼠HO-1。 第二部分LL-HO-1灌胃后重組血紅素加氧酶一1在大鼠腸道的表達(dá)情況 目的：LL-HO-1灌胃后重組HO-1在大鼠腸道的表達(dá)情況。 方法：制備LL-HO-1懸液和乳酸乳球菌懸液；然后通過不同劑量和不同次數(shù)灌胃；在規(guī)定

6、時(shí)間取回腸組織；采用酶聯(lián)免疫吸附法和免疫組化法分析回腸組織HO-1的含量。 結(jié)果：5倍、10倍LL-HO-1組重組HO-1含量比20倍組高(P<0.01)；LL-HO-1連續(xù)灌胃4天、7天組重組HO-1含量比10天組高(P<0.01)。 結(jié)論：LL-HO-1在腸道原位分泌重組HO-1的情況非常復(fù)雜。單純增加LL-HO-1灌胃劑量和次數(shù)不能有效增加回腸中HO-1的含量，反而使回腸中HO-1的含量降低。 第三部分乳酸

7、乳球菌重組HO-1對失血性休克大鼠腸道屏障的保護(hù)作用 目的：重組HO-1對失血性休克大鼠腸道屏障的保護(hù)效果。 方法：將50健康、清潔級、雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=10)：1)假手術(shù)組(sham group)：大鼠只進(jìn)行右股動脈分離和插管；2)LL-HO-1組：連續(xù)每天一次灌注活菌數(shù)達(dá)2.5×109 CFULL-HO-1菌液1m13天，然后復(fù)制失血性休克模型復(fù)制；3)LL組：連續(xù)每天一次灌注活菌數(shù)達(dá)2.5×109 CF

8、ULL菌液1m13天，然后復(fù)制失血性休克模型；4)LL-HO-1+ZnPP組：連續(xù)每天一次灌注活菌數(shù)達(dá)2.5×109 CFULL-HO-1菌液1m13天；在復(fù)制失血性休克模型前3小時(shí)皮下注射鋅原卟啉(zincprotoporphyrin IX，ZnPP)20μmol.kg-1；5)谷氨酰胺組(glutamine，Gln)：連續(xù)每天一次灌胃0.65 g.kg-1、溶解于PBS的Gln 3天。復(fù)制失血性休克模型，在液體復(fù)蘇1h取材，比較各組

9、動物的休克復(fù)蘇過程中平均動脈壓、細(xì)菌移位、回腸組織的髓過氧化酶(MPO)活性及HO-1、腫瘤壞死因子-a和白介素-10的含量，并行回腸組織病理學(xué)檢查。 結(jié)果：與LL組比較，LL-HO-1組的Chiu’s評分、細(xì)菌移位發(fā)生率、MPO活性、腫瘤壞死因子-a含量明顯降低(P<0.05)；而HO-1、IL-10含量和MAP明顯增加(P<0.05)。LL-HO-1對失血性休克腸黏膜屏障的保護(hù)作用可以被HO-1特異性拮抗劑鋅原卟啉取消。

10、 結(jié)論：乳酸乳球菌重組HO-1對失血性休克大鼠能夠較好的保護(hù)腸黏膜屏障，可以明顯減輕腸道炎癥反應(yīng)和細(xì)菌移位的發(fā)生率。 第四部分乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1對內(nèi)毒素血癥大鼠腸道的保護(hù)作用 目的：觀察乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1對內(nèi)毒素血癥大鼠腸道癥反應(yīng)及腸黏膜屏障的保護(hù)效應(yīng)。 方法：按隨機(jī)數(shù)字表法將32只健康清潔級雄性SD大鼠分為4組(n=8)：LL-HO-1組、LL組、Glu、LL-HO-1+ZnPP組。

11、分別給予攜帶HO-1基因的乳酸乳球菌、乳酸乳球菌或谷氨酰胺，每日一次，共四次。第四天腹腔內(nèi)注射內(nèi)毒素，其中鋅原卟啉于腹腔內(nèi)注射內(nèi)毒素前靜脈注射，12小時(shí)后取末端回腸。比較各組動物的死亡率，檢查腸組織病理學(xué)變化，并檢測腸組織髓過氧化物酶活性、腫瘤壞死因子-a、白細(xì)胞介素-10和血紅素加氧酶-1的含量。另取32只健康清潔級雄性SD大鼠同樣分為四組，經(jīng)過相應(yīng)的處理后，觀察其48小時(shí)的生存率。 結(jié)果：與LL-HO-1+ZnPP組比較，L

12、L-HO-1組和Glu組的生存率均明顯升高(P<0.01)；與LL-HO-1+ZnPP組、LL組比較，LL-HO-1組和Glu組的Chiu’s評分(P<0.01)和腸組織MPO活性明顯降低(P<0.01)，腸組織。TNF-a的含量明顯減低(P<0.01)，IL-10的含量卻顯著的升高(P<0.01)，HO-1的含量明顯增加(P<0.01)。 結(jié)論：乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1能明顯減輕腸道炎癥反應(yīng)；有較好的腸粘膜保護(hù)作用。

13、 結(jié)論 1、重組血紅素加氧酶-1乳酸乳球菌能夠表達(dá)具有生物活性的重組HO-1. 2、LL-HO-1在腸道原位分泌重組HO-1的情況非常復(fù)雜。單純增加LL-HO-1灌胃劑量和次數(shù)不能有效增加回腸中HO-1的含量，反而使回腸中HO-1的含量降低。 3、乳酸乳球菌重組HO-1對失血性休克大鼠能夠較好的保護(hù)腸黏膜屏障，可以明顯減輕腸道炎癥反應(yīng)和細(xì)菌移位的發(fā)生率。 4、乳酸乳球菌重組血紅素加氧酶-1能明顯減輕腸