右歸飲誘導(dǎo)股骨頭局部移植的干細(xì)胞治療缺血性股骨頭壞死的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討右歸飲誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞移植在股骨頭缺血性壞死方面的治療作用和修復(fù)機(jī)制，為臨床提供理論依據(jù)和合理的治療方法。
　　方法：1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)：所有骨髓均從成年Beagle犬下肢大粗隆下0.5cm處抽取，每只抽取骨髓8ml。所獲骨髓種植于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。培養(yǎng)液為含10％胎牛血清DMEM(低糖)液。培養(yǎng)箱溫度37oC，含5%CO2，100%飽和濕度。細(xì)胞傳代密度為1×106/cm2。傳至P3的細(xì)胞培養(yǎng)2-3天后，加

2、入含終濃度為10umol/L Brdu的DMEM培養(yǎng)基避光繼續(xù)培養(yǎng)72h。3天后當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)90%左右時(shí)，用0.25%胰蛋白酶+1mmolEDTA消化收集，PBS洗滌后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成濃度為5×106-1×107/ml的細(xì)胞懸液待用。
　　2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理：24只成年畢格犬，隨機(jī)分4組：模型對(duì)照組、右歸飲組、干細(xì)胞移植組、干細(xì)胞移植加右歸飲組各6只。所有動(dòng)物均取右側(cè)股骨頭造模左側(cè)作為自身對(duì)照，俯臥位，

3、髖關(guān)節(jié)后側(cè)切口，顯露股骨頭，保護(hù)周圍組織，用一鐵制漏斗套于股骨頭，將液態(tài)氮(100ml－150ml)倒入漏斗內(nèi)，并維持冷凍3min,用37℃溫鹽水將股骨頭復(fù)溫，逐層縫合切口。造模成功后，取右側(cè)髖關(guān)節(jié)外側(cè)切口，自粗隆頂點(diǎn)下0.5cm處向股骨頭內(nèi)鉆孔。用直徑為3.5mm鉆頭向股骨頭內(nèi)鉆入1.5cm，到達(dá)關(guān)節(jié)軟骨下，植入標(biāo)記后的MSCs0.5ml（細(xì)胞密度：5×106-1×107/ml），以骨蠟封閉穿刺孔，關(guān)閉傷口。
　　結(jié)果：1、骨髓

4、基質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)情況：MSCs懸液接種后72h后見(jiàn)細(xì)胞大部分貼壁,并延開(kāi)始伸呈成纖維樣細(xì)胞,2d后進(jìn)行首次換液,以后每3d換液1次,紅細(xì)胞等血細(xì)胞因不貼壁，隨換液后即可逐漸除去。細(xì)胞生長(zhǎng)至7d后,細(xì)胞形態(tài)基本呈梭形，細(xì)胞相互融。
　　2、股骨頭缺血性壞死模型檢測(cè)：造模后3周MRI可見(jiàn)右側(cè)股骨頭內(nèi)于T1W上出現(xiàn)均質(zhì)低信號(hào)，T2W信號(hào)升高，STIR信號(hào)升高更為明顯，呈散在、點(diǎn)狀分布于股骨頭內(nèi)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見(jiàn)少量關(guān)節(jié)積液，病理切片示骨膜不完

5、整，軟骨部分脫落，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞排列紊亂，骨小梁稀疏變細(xì)，結(jié)構(gòu)紊亂，有碎片出現(xiàn)，骨細(xì)胞陷窩空疏，骨細(xì)胞核固縮，部分血管栓塞，骨髓腔內(nèi)造血組織明顯減少，細(xì)胞數(shù)目及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較正常稀疏等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，右歸飲組較模型組的病理學(xué)、影像學(xué)改善明顯，免疫組化結(jié)果顯示VEGF的陽(yáng)性表達(dá)也相對(duì)模型組增多（P<0.05），熒光定量PCR顯示右歸飲組的VEGF表達(dá)較模型組高（P<0.01），但是干細(xì)胞移植加右歸飲組較右歸飲組的VEGF表達(dá)顯著增多（

6、P<0.01），說(shuō)明右歸飲治療股骨頭壞死的療效是肯定的，但是單純的右歸飲灌服治療相對(duì)干細(xì)胞聯(lián)合介入法的療效稍差。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植加右歸飲組較干細(xì)胞移植組的VEGF表達(dá)增多（P<0.01），說(shuō)明右歸飲和干細(xì)胞移植治療的療效較單純的右歸飲及單純的干細(xì)胞移植治療效果更佳。聯(lián)合右歸飲后，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Brdu標(biāo)記的干細(xì)胞分化為成骨、軟骨及血管的數(shù)量也增多（P<0.05），說(shuō)明右歸飲的參與可以提供干細(xì)胞分化更為有利的內(nèi)環(huán)境，對(duì)干細(xì)胞有一定的誘