外周血間充質(zhì)干細胞移植治療兔股骨頭壞死實驗研究.pdf

1、目的:富集同種異體兔外周血間充質(zhì)干細胞(PB-MSCs)，采用液氮冷凍方法制備兔股骨頭壞死模型，經(jīng)股骨頭原位注射的方法將PB-MSCs移植到股骨頭局部缺血壞死部位，繼而觀察移植療效，為評價外周血作為股骨頭壞死組織損傷修復的供體細胞新來源提供有價值的實驗依據(jù)。
　　 方法:(1)兔PB-MSCs的分離、培養(yǎng)與免疫表型鑒定:選用2～3月齡新西蘭大白兔，按30μg/(kg·d)劑量連續(xù)背部皮下注射G-CSF動員6d，第7d取兔外周血2

2、0 mL，采用密度梯度離心法分離出單個核細胞，用含20％FBS的LG-DMEM，于37℃、5％CO2飽和濕度環(huán)境下進行PB-MSCs原代培養(yǎng)，適時換液并棄除未貼壁的血細胞，當貼壁細胞生長匯合度達80％～90％時，按2～5×105/ml細胞密度進行傳代培養(yǎng)。取第2代細胞，分別用流式細胞術(CD29、CD14)和免疫細胞化學染色法(CD90、CD105、CD44、CD34、CD45)對分離培養(yǎng)的兔PB-MSCs進行表型鑒定。(2)兔股骨頭壞

3、死模型的制備:采用成年新西蘭大白兔，3％戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉動物(劑量為30 mg/kg)，無菌條件下手術逐層分離臀肌以顯露股骨頭;棉簽蘸取液氮，對股骨頭軟骨面負重區(qū)進行反復冷凍、復溫以制備股骨頭壞死模型。(3)動物實驗分組與細胞移植:實驗分為正常對照組、模型組、髓心減壓組和髓心減壓+PB-MSCs移植組。液氮冷凍后，用直徑1.2 mm鉆頭從髓心減壓組和髓心減壓+PB-MSCs移植組兩組動物股骨頸的內(nèi)后側(cè)與股骨頸方向呈30度角手動鉆入

4、股骨頭內(nèi)5mm，到達關節(jié)軟骨下，髓心減壓組鉆孔后，隨即復位股骨頭;髓心減壓+PB-MSCs移植組鉆孔后，注射入用400μL生理鹽水懸浮的第2～3代PB-MSCs（含細胞總數(shù)3～4×106個）;術后逐層關閉各組動物創(chuàng)口。(5)移植效果評價:于術后2w、4w、6w、8w隨機選取各組實驗動物，進行髖關節(jié)X線攝片，以檢測骨密度、新生骨小梁等移植后病損修復情況;攝片后分別隨機選取各時間點各組實驗動物股骨頭，縱行剖開股骨頭，一半進行固定、脫鈣、常規(guī)

5、石蠟包埋、切片（厚5μm）及HE染色，置光鏡下觀察組織病理學修復情況;另一部分股骨頭則迅速置于液氮罐中保存，用于實時聚合酶鏈反應(RT-PCR)，以檢測不同時間點各分組股骨頭PPAR-γ、BMP-2 mRNA的表達情況。
　　 結(jié)果:(1)家兔PB-MSCs培養(yǎng)形態(tài)與表型特征:原代培養(yǎng)第7～8d時形成大小不等的細胞集落，細胞呈梭形、多角形及不規(guī)則形，而后集落擴大，細胞數(shù)明顯增多，以梭形為主，到10 d左右時，細胞生長匯合度達80

6、％以上;傳代培養(yǎng)的PB-MSCs形態(tài)均一，呈長梭形漩渦狀生長。FCM分析結(jié)果顯示PB-MSCs表達CD29，不表達CD14;免疫細胞化學染色結(jié)果顯示，PB-MSCs表達CD44、CD105、CD90，不表達CD34和CD45。(2)移植療效的X線攝片結(jié)果:正常對照組各時間點股骨頭無異常改變。模型組2w時股骨頭呈現(xiàn)密度增高影像;4w時股骨頭呈現(xiàn)密度不均影像，骺板尚清晰;至6w時，股骨頭外形變得不規(guī)則，邊緣有透亮區(qū)，關節(jié)間隙略增寬，骺板較清

7、晰;8w時，股骨頭明顯塌陷，縮小，關節(jié)間隙增大，骺板模糊。股骨頭大體形態(tài)隨時間推移，其受損程度呈加重演變特點。髓心減壓組和髓心減壓+PB-MSCs移植組兩組動物術后2w時股骨頭密度均有所增加;4w時，兩組股骨頭整體密度均較2w時為增高，兩組股骨頭邊緣密度有所增高;6w時，兩組股骨頭整體均表現(xiàn)為骨小梁結(jié)構紊亂，呈現(xiàn)密度不均影像，但各組標本整體密度較之前均有所增加，髓心減壓+PB-MSCs移植組股骨頭高密度影像清晰可見，整體密度高于髓心減壓

8、組;8w時，髓心減壓組股骨頭整體密度進一步增高，呈現(xiàn)為中心區(qū)域低密度，邊緣高密度，并出現(xiàn)硬化線;髓心減壓+PB-MSCs移植組股骨頭密度整體增高，并出現(xiàn)正常的骨小梁結(jié)構。(3)移植療效的組織病理學分析:正常對照組各時間點骨小梁均完整，排列規(guī)則。模型組2w時出現(xiàn)骨小梁斷裂、排列紊亂，脂肪細胞融合成小囊;4w時髓腔內(nèi)脂肪細胞出現(xiàn)壞死;骨小梁周圍纖維組織增生;6w時修復區(qū)出現(xiàn)纖維化骨的爬行替代;8w時骨小梁斷裂，細胞被擠壓變形，可見類骨質(zhì)和骨

9、小梁等新生骨組織生成。髓心減壓+PB-MSCs移植組2w時，鉆孔區(qū)出現(xiàn)大量新生骨小梁和類骨質(zhì);4w時，兩組鉆孔區(qū)均出現(xiàn)較多新生骨小梁和骨髓組織;6w時，髓心減壓組鉆孔區(qū)內(nèi)骨小梁已趨成熟，髓心減壓+PB-MSCs移植組鉆孔區(qū)出現(xiàn)大量的骨小梁和骨髓組織;8w時髓心減壓組鉆孔區(qū)邊緣仍有修復現(xiàn)象，鉆孔區(qū)內(nèi)出現(xiàn)大量骨髓組織，骨小梁分布不均，髓心減壓+PB-MSCs移植組鉆孔區(qū)內(nèi)骨小梁已趨成熟，并有大量骨髓組織形成。(4)PPAR-γ和BMP-2表

10、達的熒光定量PCR結(jié)果:模型組各觀察時間點股骨頭內(nèi)PPAR-γ mRNA的表達量均高于正常組(P＜0.05)，其中PPAR-γmRNA在造模后2～6 w，隨著時間的延長其表達量呈上升趨勢(P＜0.05);髓心減壓組PPAR-γ mRNA的表達量在各時間點均明顯低于模型組(P＜0.01)，且隨著時間的延長呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢，至8 w時又明顯上升;髓心減壓+PB-MSCs移植組PPAR-γ mRNA表達量隨時間延長呈現(xiàn)出與模型組相同的

11、趨勢，但均明顯低于相對應模型組的表達量;8w時，髓心減壓+PB-MSCs移植組PPAR-γ mRNA表達量明顯低于髓心減壓組(P＜0.01)。模型組各時間點BMP-2mRNA的表達量明顯低于正常組（P＜0.01），且隨著時間的延長，模型組BMP-2mRNA的表達量變化不明顯;髓心減壓組BMP-2 mRNA的表達量明顯低于相對應正常組的表達(P＜0.01);髓心減壓+PB-MSCs移植組BMP-2 mRNA的表達量呈現(xiàn)出先升高再下降而后又