基于血液樣品和微流控芯片技術(shù)的細(xì)胞分離、PCR擴(kuò)增及DNA測序方法研究.pdf

1、生命科學(xué)是本世紀(jì)前沿科學(xué)領(lǐng)域之一，生命科學(xué)的高速發(fā)展離不開先進(jìn)的分析儀器與技術(shù)，隨著生命科學(xué)的蓬勃發(fā)展，分析儀器和分析科學(xué)也正經(jīng)歷著深刻的變革，其中一個(gè)日益明顯的發(fā)展趨勢(shì)就是儀器設(shè)備的微型化、集成化與便攜化。微流控芯片技術(shù)作為微流控分析系統(tǒng)的核心部分已發(fā)展成為μTAS中最活躍的領(lǐng)域，血液是一種重要的生物分析樣本，含有極其豐富的有關(guān)體內(nèi)所有組織和器官功能的信息，因此對(duì)血液樣品進(jìn)行分析是醫(yī)學(xué)和科學(xué)領(lǐng)域研究關(guān)注的焦點(diǎn)。本文用微流控芯片技術(shù)設(shè)計(jì)

2、制作了細(xì)胞水平和DNA水平上對(duì)人血液進(jìn)行分析的芯片，實(shí)現(xiàn)了利用高梯度磁分離技術(shù)對(duì)未經(jīng)標(biāo)記的血細(xì)胞進(jìn)行直接分離、直接全血PCR擴(kuò)增及流動(dòng)焦磷酸測序法人血液DNA的SNP位點(diǎn)檢測，展示了微流控芯片在生物分析中的發(fā)展?jié)摿Α?br>　　 第一章簡要論述了微流控芯片血細(xì)胞操控與分離、微流控芯片PCR擴(kuò)增和焦磷酸測序微流控芯片的研究情況。
　　 第二章在基于高梯度磁分離技術(shù)(High Gradient Magnetic Separatio

3、n, HGMS)的玻璃微流控芯片連續(xù)血細(xì)胞分離研究中，設(shè)計(jì)并制作了一個(gè)在細(xì)胞水平上進(jìn)行血液分析的玻璃微流控芯片系統(tǒng)，是基于HGMS技術(shù)連續(xù)分離血細(xì)胞，并且成功地進(jìn)行了血細(xì)胞分離。玻璃芯片用光刻法和熱封合法加工制成，包括一個(gè)進(jìn)口和三個(gè)出口，一個(gè)直徑69μm的鎳絲被定位在分離通道的中間，通道上寬149μrn、深73μrn，將鎳絲定位的一對(duì)嵴高約10μm，這兩個(gè)嵴是在刻蝕通道的同時(shí)形成的。當(dāng)在芯片旁放置一個(gè)與通道平行的0.3T的永磁鐵，在永磁

4、鐵形成的磁場中，鎳絲就會(huì)在分離通道中誘導(dǎo)出高梯度磁場，稀釋了41倍的血液樣品中的紅細(xì)胞在流量范圍為0.12～0.92μL/min時(shí)不斷地被分離，在流量為0.23μL/min時(shí)，在中間出口的紅細(xì)胞分離率為93.7％。通過用牛血清白蛋白調(diào)整支持介質(zhì)的密度，減輕了細(xì)胞的沉降現(xiàn)象。在分離過程中使用了量子點(diǎn)標(biāo)記，在可視熒光下觀察細(xì)胞的分離行為。發(fā)現(xiàn)并討論了鎳絲兩側(cè)血細(xì)胞分布不均勻現(xiàn)象。
　　 第三章在直接全血PCR擴(kuò)增方法研究及其在靜態(tài)微

5、池型PCR芯片上的應(yīng)用中，是在DNA水平上應(yīng)用擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行血液分析微流控芯片的研究。首先通過將改進(jìn)的PCR程序和優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系結(jié)合起來進(jìn)行直接全血PCR擴(kuò)增，成功的進(jìn)行了血液內(nèi)源基因P53片段（大約543bp）和外源的靶目標(biāo)λDNA片段(大約500bp)的擴(kuò)增。此方法還可應(yīng)用于不同處理的血液樣品，如不同抗凝劑（和檸檬酸鈉）血液、未加抗凝劑的新鮮血液、濾紙上的血斑等。然后在自制的靜態(tài)微池型PCR芯片上，利用此PCR擴(kuò)增方法也成功的實(shí)

6、現(xiàn)了芯片上的直接全血PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增得到兩個(gè)不同長度的血液內(nèi)源靶目標(biāo)P53基因和K-ras基因(157bp)片段，在10μL的反應(yīng)體系中只需加入0.5μL的血液，此PCR芯片是采用ITO玻璃為基底，用模糊PID算法來控制芯片的溫度程序，芯片加熱器的有效面積是25×25mm，一個(gè)聚乙烯管粘在玻璃面上做為PCR反應(yīng)池。在整個(gè)過程中，僅涉及芯片加熱程序，因此所做的PCR芯片可適用于野外檢測等。
　　 第四章在毛細(xì)管流動(dòng)焦磷酸測序

7、方法的建立及其在單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測中的應(yīng)用中，是在DNA水平上應(yīng)用測序技術(shù)進(jìn)行血液分析微流控芯片的研究。利用毛細(xì)管反應(yīng)和磁固定的方法搭建了一個(gè)流動(dòng)焦磷酸測序毛細(xì)管微流控系統(tǒng)平臺(tái)，利用PCR擴(kuò)增血液DNA制備了帶有生物素標(biāo)記的模板，通過生物素與鏈親和素親和作用將模板固定在磁珠上，利用永磁鐵將連著測序模板的磁珠固定在毛細(xì)管上，光電倍增管做為檢測器以及縫管陣列和注射泵做為進(jìn)樣系統(tǒng)。對(duì)所建立的毛細(xì)管流動(dòng)焦磷酸測序方法反應(yīng)條件等因素進(jìn)行

8、了研究；在初步優(yōu)化的基礎(chǔ)上成功地用于血液DNA的SNP位點(diǎn)研究。制作了一個(gè)磁屏蔽盒用來消除磁場對(duì)光電倍增管檢測器檢測靈敏度的影響。此平臺(tái)搭建簡單，不涉及微加工操作，而且通過與縫管陣列進(jìn)樣系統(tǒng)聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了微量、連續(xù)進(jìn)樣，滿足了流動(dòng)焦磷酸測序反應(yīng)對(duì)進(jìn)樣系統(tǒng)的要求，且操作簡單、方便，在該平臺(tái)上結(jié)合高靈敏度的BAMPER方法建立了高靈敏度的毛細(xì)管流動(dòng)焦磷酸測序方法，成功地對(duì)人21號(hào)染色體上的一個(gè)SNP位點(diǎn)rs8130833進(jìn)行了檢測，得到了與傳