地塞米松磷酸鈉導(dǎo)致斑馬魚顱面部發(fā)育異常的研究.pdf

1、糖皮質(zhì)激素是一類內(nèi)源性的類固醇激素，其表達(dá)受下丘腦-垂體-腎上腺軸控制。這些糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，分化和凋亡，在生命活動的調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用。糖皮質(zhì)激素類藥物地塞米松磷酸鈉是一類應(yīng)用廣泛的處方藥，主要作用是抗炎和免疫抑制。臨床上用于治療哮喘，皮炎，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和一些自身免疫性疾病，也用于抑制移植排斥反應(yīng)。然而，地塞米松磷酸鈉也具有致畸作用，最常見的致畸效應(yīng)就是腭裂。
　　 通常使用哺乳動物模型研究人類疾病和篩選藥物，這是

2、由于哺乳動物基因組具有高度同源性。但是，建立哺乳動物模型耗時，昂貴，而且在體和離體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相差較大，不能有效的進(jìn)行毒性預(yù)測。
　　 斑馬魚是最具有潛力的在體毒理學(xué)模式生物之一。它是一種公認(rèn)的評價藥物發(fā)育毒性的理想模型。斑馬魚胚胎發(fā)育過程中對環(huán)境因素的影響極為敏感。而且斑馬魚胚胎實(shí)驗(yàn)是一種無痛的在體實(shí)驗(yàn)，正在逐漸替代其他類型的動物實(shí)驗(yàn)。斑馬魚用于毒性實(shí)驗(yàn)，很大程度上得益于與人類基因組高度同源?；虻耐葱允沟冒唏R魚有與人類類似的生

3、理和解剖學(xué)特征。對外源性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)也與人類非常類似。而且，斑馬魚胚胎的透明特征使得實(shí)驗(yàn)中可以直接觀察胚胎發(fā)育的各個時期，包括器官形成，血管形成和毒性反應(yīng)中形態(tài)學(xué)的變化。最后，斑馬魚實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低，這是因?yàn)榘唏R魚個體小，需要的養(yǎng)殖費(fèi)用相對哺乳動物大大降低。
　　 目前國內(nèi)外以斑馬魚為模式生物進(jìn)行藥物毒性試驗(yàn)和前期篩選尚處于起步階段，本文以斑馬魚為模式生物通過測定LC50值，觀察形態(tài)學(xué)改變，測定相關(guān)基因表達(dá)的改變，研究地塞米松磷酸鈉

4、導(dǎo)致斑馬魚顱面部發(fā)育異常的機(jī)制，同時建立一種以斑馬魚為模式生物簡便的預(yù)測藥物發(fā)育毒性的方法。
　　 第一部分：地塞米松磷酸鈉對斑馬魚半數(shù)致死濃度的測定
　　 目的：研究地塞米松磷酸鈉對斑馬魚的半數(shù)致死濃度，評價斑馬魚模型對哺乳動物毒性數(shù)據(jù)預(yù)測的準(zhǔn)確性。
　　 方法：采用寇氏法計算地塞米松磷酸鈉對斑馬魚的LC50值，將所得結(jié)果與哺乳動物的半數(shù)致死量進(jìn)行線性回歸分析。
　　 結(jié)果：測定得地塞米松磷酸鈉對斑馬魚

5、的LC50值為443.86mg/L。且與大鼠的LD50值存在線性關(guān)系。
　　 結(jié)論：斑馬魚作為動物模型分析藥物毒性，所需藥物量少，且對哺乳動物的LD50具有良好的預(yù)測性。
　　 第二部分：地塞米松磷酸鈉導(dǎo)致斑馬魚顱面部畸形
　　 目的：以斑馬魚作為模式生物，研究地塞米松磷酸鈉對斑馬魚顱面部發(fā)育的毒性，以期建立起一種快速，直觀，準(zhǔn)確的藥物發(fā)育毒性的動物模型評價體系。
　　 方法：斑馬魚胚胎分為4組，分別為c

6、ontrol組，地塞米松磷酸鈉5，10，50mg/L實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行作用至受精后96小時停止。計算胚胎的孵出率，存活率，畸形率和心率；進(jìn)行體視顯微鏡觀察，AO染色和Alcian-Blue染色后觀察斑馬魚胚胎及幼魚顱面部發(fā)育畸形和細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果：與control組相比，斑馬魚胚胎的孵出率，存活率，畸形率和心率均發(fā)生變化，其中畸形率變化顯著，50 mg/L實(shí)驗(yàn)組畸形率高達(dá)71.33±6.5%，相對于control組4.67±

7、1.8%；體視顯微鏡觀察到各實(shí)驗(yàn)組均有發(fā)育畸形現(xiàn)象存在，50 mg/L實(shí)驗(yàn)組畸形最為嚴(yán)重；AO染色顯示相對于control組，5，10，50mg/L實(shí)驗(yàn)組均存在細(xì)胞調(diào)亡現(xiàn)象；Alcian-Blue染色進(jìn)一步證實(shí)了地塞米松磷酸鈉導(dǎo)致顱面部軟骨發(fā)育畸形。
　　 結(jié)論：應(yīng)用斑馬魚為模式生物進(jìn)行地塞米松磷酸鈉顱面部發(fā)育毒性實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)與其他模式生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一致。斑馬魚為模式生物進(jìn)行發(fā)育毒性分析耗時少，成本低，結(jié)果具有良好的預(yù)測性，可以

8、作為傳統(tǒng)模式生物的替代模型快速，直觀，準(zhǔn)確的進(jìn)行藥物毒性評價。
　　 第三部分：地塞米松磷酸鈉對斑馬魚顱面發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　 目的：研究地塞米松磷酸鈉對斑馬魚顱面部發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響。同時以斑馬魚為模式生物，建立一種通過測定相關(guān)基因的表達(dá)變化，研究化合物發(fā)育毒性的便捷方法。
　　 方法：斑馬魚胚胎分為4組，分別為control組，地塞米松磷酸鈉5，10，50mg/L實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)行作用至受精后96小時停

9、止。采用熒光定量PCR法測定斑馬魚中顱面部發(fā)育相關(guān)基因egf、tgf β1和mmp-13的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：與control組相比，地塞米松磷酸鈉作用后48，72，96小時均促進(jìn)egf、tgf β1和mmp-13 mRNA表達(dá)水平升高。
　　 結(jié)論：地塞米松磷酸鈉引起egf、tgf β1和mmp-13 mRNA表達(dá)水平升高，斑馬魚顱面部發(fā)育異?？赡芘c這些基因的表達(dá)增多有關(guān)。同時，斑馬魚與哺乳動物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能具有