基因槍介導玉米pepc基因轉(zhuǎn)入小麥的研究.pdf

1、本研究選取在黃淮麥區(qū)具有一定生產(chǎn)應(yīng)用價值的16份小麥品種(系)，通過比較不同基因型幼穗和幼胚愈傷組織誘導、增殖及分化的差異，篩選出組培特性較好，綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因受體基因型；構(gòu)建含有g(shù)us基因和bar基因的高光效表達載體；研究幼胚愈傷組織對潮霉素和L-PPT(草丁膦)的敏感性，確定了合適的選擇濃度；研究基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚的影響因素并對獲得的抗性植株進行了檢測。 本研究獲得了如下結(jié)果： 1．小麥遺傳轉(zhuǎn)化受體基因型的篩選

2、 1．1幼穗培養(yǎng)篩選結(jié)果 將供試的16個小麥材料的幼穗接種到誘導培養(yǎng)基上，不同基因型出愈時間沒有明顯差異。不同基因型衍生的愈傷組織質(zhì)量差異較為明顯。不同基因型的幼穗愈傷組織誘導率存在顯著差異。增殖率率在四次繼代過程中存在顯著差異，K35幼穗愈傷組織增殖率在四次繼代過程中一直保持最高；周19、01H186-20-24、2000H841-15-1-3、2000 H 1012-2-1-5、鄭麥9023愈傷組織生長較快，增殖率在四

3、次繼代過程中均較高。幼穗愈傷組織在分化培養(yǎng)基上進行分化時，不同基因型愈傷組織綠點分化率和綠苗分化率在四次繼代過程中存在顯著差異。繼代培養(yǎng)過程中，16個基因型的分化頻率均有一定程度的下降，但各基因型之間下降的幅度不同，從而在分化能力的保持方面表現(xiàn)出——定的差異。周19、2000H863-13-4-4、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5、K35幼穗愈傷組織綠點分化率在1-4次繼代過程中均較高；周19、2000H8

4、63-13-4-4、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5幼穗愈傷組織綠苗分化率在1-4次繼代過程中均較高。 1．2幼胚培養(yǎng)篩選結(jié)果 將供試的16個小麥材料的幼胚接種到誘導培養(yǎng)基上，不同基因型出愈時間存在差異。不同基因型衍生的愈傷組織質(zhì)量差異較為明顯。各基因型幼胚出愈率沒有差異。經(jīng)過四次繼代后各基因型幼胚愈傷組織增殖率存在明顯差異，觀35、周19、01H186-20-24、2000H841-15-

5、1-3、2000 H 1012-2-1-5其愈傷組織生長較快，增殖率在四次繼代過程中均較高。幼胚愈傷組織在分化培養(yǎng)基上進行分化時，周19、01H186-20-24、2000H863-13-4-4、2000H841-15-1-3、2000H1012-2-1-5、K35幼胚愈傷組織綠點分化率在1-4次繼代過程中均較高；周19、2000H863-13-4-4、2000H1012-2-1-5幼胚愈傷組織綠苗分化率在1-4次繼代過程中均較高，且叢

6、生苗較多，生長健壯。綜合幼穗、幼胚試驗結(jié)果，周19和2000H1012-2-1-5的組織培養(yǎng)特性較好，可作為小麥離體培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因受體材料的優(yōu)良基因型。16個基因型的幼穗和幼胚在四次繼代的過程中，出愈率和增殖率并無顯著差異，但幼胚愈傷組織分化綠苗率明顯高于幼穗愈傷組織分化綠苗率，且幼穗取材數(shù)量受限制，因此我們認為幼胚比幼穗更適合作為小麥組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的外植體。 2．高光效表達載體的構(gòu)建 將來自C<,4>作物(玉米)光合

7、作用中的高光效基因pepc基因插入到植物表達質(zhì)粒pPPC中，獲得了攜帶gus基因和bar基因的植物表達載體pPC46。經(jīng)酶切和PCR檢測，證明載體構(gòu)建成功。 3．小麥幼胚愈傷組織對潮霉素和L-PPT敏感性試驗 周19和2000H1012-2-1-5對潮霉素濃度敏感性不同。周19對潮霉素的耐受性比2000H1012-2-1-5強。潮霉素110 mg/L是周19小麥幼胚愈傷組織比較理想的篩選濃度。潮霉素80 mg/L是200

8、0H1012-2-1-5小麥幼胚愈傷組織比較理想的篩選濃度。 周19和2000H1012-2-1-5幼胚愈傷組織接入附加不同濃度L-PPT的繼代培養(yǎng)基，各處理之間幼胚愈傷組織的生長沒有明顯差異。轉(zhuǎn)入附加L-PPT的分化培養(yǎng)基中，同一基因型各處理之間幼胚愈傷組織在分化階段對L-PPT的敏感性差異明顯，L-PPT6mg/L是周19和2000H1012-2-1-5幼胚愈傷組織比較理想的分化篩選濃度。 4．基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚影響

9、因素研究 以gus基因的瞬時表達和愈傷組織的綠芽分化率作為評價基因槍轟擊效果的衡量指標，對影響基因槍轉(zhuǎn)化效率的轟擊參數(shù)：轟擊壓力、轟擊距離、金粉用量、轟擊次數(shù)等進行了研究。結(jié)合GUS染色結(jié)果和愈傷組織的綠芽率，基因槍轉(zhuǎn)化2000H1012--2-1-5合適的轟擊壓力是900psi，轟擊距離是9cm，金粉用量是250μg/槍，轟擊次數(shù)是1次。 5．抗性植株的檢測 采用pPC46表達載體和經(jīng)優(yōu)化的基因槍轟擊參數(shù)進行基