基因槍介導(dǎo)P-,SAG12--IPT基因轉(zhuǎn)化非洲菊及其抗衰老機(jī)理的研究.pdf

1、1.基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化非洲菊再生體系的建立 以非洲菊“雨燕”品種為材料，研究了BA和NAA不同濃度組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)增殖的影響；基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的不同轟擊距離對(duì)轉(zhuǎn)化率影響。結(jié)果表明：1.5mgL-1BA的培養(yǎng)基上增殖系數(shù)最高，達(dá)8.96倍；9cm的目標(biāo)轟擊距離轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到10.9％。建立了非洲菊的再生和轉(zhuǎn)基因體系，為非洲菊基因工程育種打下基礎(chǔ)。 2.轉(zhuǎn)基因非洲菊的分子生物學(xué)鑒定 本試驗(yàn)利用PCR和South

2、ern雜交的分子生物學(xué)方法對(duì)所獲得的非洲菊抗Kan材料進(jìn)行鑒定，從106個(gè)材料中得到了26個(gè)PCR陽(yáng)性的非洲菊轉(zhuǎn)基因材料。再?gòu)?6個(gè)PCR陽(yáng)性的非洲菊轉(zhuǎn)基因材料中，利用Southern分子雜交，獲得17個(gè)陽(yáng)性材料。通過干旱脅迫，確認(rèn)了3個(gè)株系具有抗逆能力。從中選出1個(gè)典型株系作為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)材料。 3.滲透脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因非洲菊葉片抗氧化酶系統(tǒng)活性的影響 采用葉圓片離體培養(yǎng)技術(shù)，研究了PEG6000滲透脅迫誘導(dǎo)的衰老對(duì)轉(zhuǎn)基因和

3、對(duì)照植株葉片中抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因非洲菊和對(duì)照材料的葉圓片在滲透脅迫中，葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量均顯著降低，但在轉(zhuǎn)基因的非洲菊葉片中各種色素含量下降幅度較小。在滲透脅迫下，植株葉圓片中蛋白質(zhì)含量降低，與對(duì)照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株葉片中蛋白質(zhì)含量的下降幅度明顯減小。在滲透脅迫下，葉圓片中抗氧化酶(SOD、CAT、APX、GPX、DHAR)活性都有所增加，但轉(zhuǎn)基因植株酶活性的增加幅度顯著高于對(duì)照植株，差異

4、達(dá)到顯著水平。滲透脅迫下，對(duì)照植株葉片中MDA含量顯著上升，但轉(zhuǎn)基因植株葉片中的含量卻增加很少。20％PEG脅迫對(duì)葉片中脯氨酸含量的影響較小，而40％PEG脅迫顯著地增加了脯氨酸的含量，在轉(zhuǎn)基因植株葉圓片中的含量大約是對(duì)照植株中的兩倍。這些結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因非洲菊表現(xiàn)出比野生型對(duì)照的非洲菊植株具有更強(qiáng)的抗衰老能力，其抗衰老能力的增加可能與抗氧化酶活性的增加有關(guān)。 4.轉(zhuǎn)PSAG12-IPT非洲菊植株抗氧化系統(tǒng)活性對(duì)光氧化脅迫的響應(yīng)

5、 采用葉圓片離體培養(yǎng)技術(shù)，研究了百草枯(Paraquat，PQ)誘導(dǎo)的光氧化脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因非洲菊和對(duì)照植株葉片衰老的影響。結(jié)果表明，百草枯處理顯著地促進(jìn)了植株的衰老，葉圓片中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均顯著下降，但在轉(zhuǎn)基因的植株中下降幅度較小。轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株的葉片中可溶性蛋白的含量隨著脅迫程度的增加而明顯下降，但是，在對(duì)照植株葉圓片中蛋白質(zhì)含量的下降程度明顯高于轉(zhuǎn)基因植株。SOD的活性隨PQ濃度的增加顯著增加，特

6、別是在轉(zhuǎn)基因植株中活性升高很快，顯著高于對(duì)照植株。CAT的活性和DHAR的活性呈現(xiàn)出與SOD相同的趨勢(shì)。APX和GPX的活性在本實(shí)驗(yàn)中兩個(gè)PQ處理濃度中均沒有檢測(cè)到。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的產(chǎn)物，隨著百草枯(PQ)處理濃度的提高，植株葉片中MDA的含量顯著上升。在相同百草枯(PQ)的濃度下，轉(zhuǎn)基因植株葉片中MDA的積累量要低于對(duì)照植株。因此，我們可以推論，轉(zhuǎn)入融合基因PSAG12-IPT的非洲菊植株葉片具有較強(qiáng)的抗氧化能力，從而延

7、緩了植株的衰老。 5.轉(zhuǎn)PSAG12-IPT基因植株葉片的抗氧化系統(tǒng)對(duì)干旱脅迫的響應(yīng) 在溫室中，對(duì)轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株進(jìn)行干旱脅迫處理，然后再恢復(fù)水分供應(yīng)。外觀形態(tài)學(xué)的觀察表明，干旱脅迫后第6天對(duì)照植株所有葉子失水全部下垂，而轉(zhuǎn)基因植株新葉直立沒有下垂，直到第8天轉(zhuǎn)基因植株的葉片才完全失水下垂。結(jié)果表明，干旱處理后非洲菊葉片中MDA的含量顯著上升，水分恢復(fù)供應(yīng)6天后，MDA的含量有所下降，但是并沒有降低到原有的水平。但是在相

8、同的脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株葉片中的MDA濃度要低于對(duì)照植株。經(jīng)過干旱脅迫6天后，轉(zhuǎn)入融合基因PSAG12-IPT的非洲菊葉片中抗氧化酶SOD、CAT、APX、GPX、DHAR和GR的活性明顯高于對(duì)照植株?；謴?fù)澆水后6天，SOD、CAT、APX、GPX、DHAR和GR的活性在轉(zhuǎn)基因植株葉片中仍然高于對(duì)照植株。轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株葉片中的可溶性蛋白含量脅迫后明顯下降，在對(duì)照植株葉片中蛋白質(zhì)含量的下降程度明顯高于轉(zhuǎn)基因植株?；謴?fù)澆水后6天，葉片中

9、蛋白質(zhì)含量有所增加，轉(zhuǎn)基因植株葉片中蛋白質(zhì)含量的恢復(fù)速度顯然高于對(duì)照植株。由此，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性高于對(duì)照，這可能與植株抗氧化酶活性增加有關(guān)。 6.干旱脅迫對(duì)轉(zhuǎn)PSAG12-IPT非洲菊葉片光合作用和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響 用葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)技術(shù)，研究干旱條件對(duì)轉(zhuǎn)基因非洲菊葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)，即光合電子量子傳遞效率(ΦPSⅡ)、光照條件下可變熒光與最大熒光的比值(Fv'/Fm’)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)、電子傳遞速率(

10、ETR)的影響，以及干旱條件對(duì)轉(zhuǎn)基因非洲菊光合作用速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)的影響。結(jié)果表明，干旱脅迫對(duì)非洲菊葉綠素?zé)晒鈪?shù)和光合作用參數(shù)影響較大。隨著干旱脅迫的加劇，ΦPSⅡ、Fv'/Fm’、qP、ETR都表現(xiàn)出降低的趨勢(shì)，Pn、Gs也出現(xiàn)同樣的趨勢(shì)。干旱脅迫的結(jié)果，ΦPSⅡ和ETR的下降，光合作用降低，Pn、Gs下降。隨著干旱脅迫的結(jié)束(澆水的恢復(fù))，ΦPSⅡ、Fv'/Fm’、qP、ETR、Pn、Gs都顯著上升。與對(duì)照植株相比，