三葉草的細(xì)胞學(xué)、分子標(biāo)記及多倍體誘導(dǎo)研究.pdf

1、三葉草是豆科蝶形花亞科三葉草屬植物,其中白三葉、雜三葉是優(yōu)質(zhì)牧草,紅三葉既是優(yōu)質(zhì)牧草又是藥用植物,其提取物具有植物雌激素樣作用和抗癌作用,是目前國際上公認(rèn)的治療更年期綜合征療效確切的植物藥。以上三種三葉草在我國有著廣泛的分布,經(jīng)長期的自然選擇和人工選擇,三葉草種內(nèi)產(chǎn)生了明顯的分化,形成了豐富的種質(zhì)資源。本研究運(yùn)用常規(guī)的細(xì)胞學(xué)方法和近年來新發(fā)展起來的SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對8種三葉草的種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性的研究,以期為三葉草的品種選育及

2、三葉草種間親緣關(guān)系的研究提供細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)依據(jù)。此外,本文還對實驗中意外發(fā)現(xiàn)的一種白三葉材料中的B染色體進(jìn)行了研究,并進(jìn)一步探索了巴東紅三葉草多倍體的誘導(dǎo)方法。其主要結(jié)果如下:
　　 1.細(xì)胞學(xué)研究
　　 不同品種的白三葉草染色體數(shù)目相同均為2n=32,不同品種的紅三葉草染色體數(shù)目為2n=14,雜三葉2n=16。其中有一種白三葉草除具有正常的32條染色體外,還發(fā)現(xiàn)有B染色體存在。白三葉草中具有葉型變異的植株與葉型正常植株

3、的染色體數(shù)目相同,均為2n=32。核型分析結(jié)果表明:不同品種白三葉草的核型公式、染色體相對長度組成和核型類型均存在較大差異；與已報道的白三葉草雖然在染色體數(shù)目上相同,但核型公式、染色體相對長度組成和核型類型等方面存在差異。不同品種紅三葉草之間的核型公式、染色體相對長度組成和核型類型也有較大差異。說明不同品種的白三葉草和不同品種的紅三葉草在細(xì)胞水平上均存在遺傳多樣性。
　　 2.SRAP分子標(biāo)記
　　 經(jīng)過PCR反應(yīng)體系和

4、擴(kuò)增體系的優(yōu)化,共篩選出40對SRAP引物對4份白三葉草、3份紅三葉草、1份雜三葉草及其10份葉型變異材料進(jìn)行擴(kuò)增。共擴(kuò)增出792條帶,其中多態(tài)性條帶426,每個引物組合的多態(tài)性條帶數(shù)為3-38不等,平均每個引物組合產(chǎn)生個多態(tài)性條帶10.8,說明SRAP分子標(biāo)記完全可以應(yīng)用于三葉草的遺傳學(xué)研究。本試驗中優(yōu)化的SRAP分子標(biāo)記體系也為今后其應(yīng)用打基礎(chǔ)。
　　 在相似系數(shù)為0.568時,可以將供試材分為3大類,一類為雜三葉草；一類為

5、紅三葉草;另一類為白三葉草。雜三葉與紅三葉的親緣關(guān)系相對較近,相似系數(shù)為0.559,與白三葉的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn),相似系數(shù)0.504。在白三葉草中,相似系數(shù)為0.879時,可分為六類:三種白三葉草的親緣關(guān)系最近為一類,武漢野生白三葉草一類,葉型變異的白三葉草分為四類。在DNA分子水平上,與白三葉草相比,紅三葉草種內(nèi)存在更為豐富的遺傳多樣性,特別是巴東紅三葉草與另外兩種紅三葉草的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn),平均遺傳相似系數(shù)僅為0.482。說明紅三葉草

6、種內(nèi)資源能為優(yōu)良品種的選育提供好的基礎(chǔ)。
　　 從SRAP標(biāo)記聚類分析得到有葉型變異植株和正常植株并沒有聚為一類,其相似系數(shù)低于白三葉草種內(nèi)相似系數(shù),說明葉型變異植株和正常植株在DNA序列上有差異。
　　 3.白三葉草B染色體研究
　　 本研究發(fā)現(xiàn)在白三葉草的一個品種中有B染色體存在,其它幾個品種中并未發(fā)現(xiàn)。前人對白三葉草的染色體數(shù)目及減數(shù)分裂過程中的染色體行為及核型分析已有研究,但都沒有關(guān)于發(fā)現(xiàn)B染色體的報道。

7、對具有B和不具有B的核型比較觀察,二者沒有明顯差異。B染色體形態(tài)上比A染色體小,通常小于1μm。在同一根尖的細(xì)胞中,所含的B染色體數(shù)目不同,在0～3之間變化。通過有絲分裂和減數(shù)分裂觀察表明,B染色體是額外的,全部異染色質(zhì)化,分離不規(guī)則。05年、06年B染色體在群體中的頻率變化不大,差異不顯著。
　　 4.巴東紅三葉草的多倍體誘導(dǎo)
　　 以巴東紅三葉草為材料,用秋水仙素直接處理萌動的種子和組織培養(yǎng),進(jìn)行了多倍體誘導(dǎo)方法的研

8、究。結(jié)果表明:在秋水仙素3個濃度梯度和4個時間梯度的誘導(dǎo)中,濃度為0.1％和時間為16h效果較好。取根尖進(jìn)行染色體制片觀察顯示有四倍體和嵌合體。
　　 在組織培養(yǎng)誘導(dǎo)中,以葉片、葉柄、子葉和下胚軸為外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率都在90％以上,但從愈傷的長勢和質(zhì)量看,下胚軸是最理想的誘導(dǎo)材料。在培養(yǎng)基中添加1.1mg/L秋水仙素溶液處理15d效果最佳,再生植株的誘導(dǎo)率最高為46.7％,離體間接誘導(dǎo)法總體上要比活體誘導(dǎo)法效果好,可獲得較多