人髓核細胞的生物學特性研究與組織工程椎間盤的體外構(gòu)建.pdf

1、目的：通過研究不同代次人髓核細胞的形態(tài)、增殖活性和表型表達變化，篩選出組織工程椎間盤研究適宜的種子細胞，并研究轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)和胰島素樣生長因子-1(insulin-likegrowthfactor1，IGF-1)對髓核細胞增殖和表型表達的影響，探討TGF-β1和IGF-1在組織工程椎間盤研究中的應(yīng)用價值，通過制備聚乳酸—羥基乙酸(PLGA)三維框架，將種子細胞與框

2、架結(jié)合，體外構(gòu)建組織工程椎間盤。 方法：(1)從人正常和退變髓核組織分離培養(yǎng)髓核細胞，分別取不同代次細胞作為研究對象，通過光鏡和電鏡下觀察細胞形態(tài)，對生長曲線、MTT攝取等進行測定，RT-PCR方法測定細胞的聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白mRNA的表達，來確定組織工程椎間盤的種子細胞。(2)將人正常傳2代髓核細胞作為研究對象，采用MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽)法和RT-PCR技術(shù)，探索TGF-β1和IG

3、F-1對細胞的形態(tài)、增殖以及Ⅱ型膠原和Aggrecan的調(diào)節(jié)作用，及其時效與量效的關(guān)系。(3)將人正常髓核細胞種植于聚乳酸—羥基乙酸(PLGA)三維多孔框架，構(gòu)建了組織工程椎間盤，通過MTT攝取、激光共聚焦熒光顯微鏡及掃描電鏡的方法進行體外觀察。 結(jié)果：(1)體外培養(yǎng)條件下，可見退變髓核細胞排列較紊亂，粗面內(nèi)織網(wǎng)輕度擴張。在接種相同的細胞密度和相同的培養(yǎng)條件下，成人正常和退變髓核細胞的生長曲線存在差異；二者的MTT攝取在傳1代時

4、差異均無顯著性(P＞0.05)，傳3、5代時差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。不同代次正常髓核細胞比較，傳3代之前細胞形態(tài)良好，從傳4代起，部分細胞向長梭形演化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張。生長曲線和MTT試驗提示傳3代之前的細胞增殖能力強。RT-PCR實驗提示，正常髓核細胞前3代表達Ⅱ型膠原和Aggrecan旺盛，從傳4代起開始減少，其中Aggrecan減少更明顯；退變髓核細胞不僅表達Ⅱ型膠原和Aggrecan，而且表達少量Ⅰ型膠原。(2)在1

5、％血清條件下，TGF-β1具有促增殖作用。在10％血清條件下，TGF-β1和IGF-1均能提高細胞的增殖活性，并且在各自一定的濃度范圍內(nèi)呈劑量效應(yīng)關(guān)系。二者聯(lián)合應(yīng)用作用效果更顯著。10ug/L、100ug/LTGF-β1組和100ug/LIGF-1在促進Aggrecan和Ⅱ型膠原基因表達方面也作用顯著，其中，10ug/L組TGF-β1作用最明顯。(3)細胞種植于PLGA框架后，行MTT攝取實驗提示細胞—框架復合體呈深藍著色，縱行剖開，可

6、見藍色晶體均勻分布于整個材料支架內(nèi)部。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察可見大量紅色熒光著色的細胞貼附于支架結(jié)構(gòu)內(nèi)，掃描電鏡可見大量細胞貼附于支架內(nèi)，并可見少量細胞外基質(zhì)分泌。 結(jié)論：(1)本研究提示成人正常髓核細胞傳代后前3代細胞形態(tài)良好，增殖能力強，Aggrecan和Ⅱ型膠原mRNA表達良好，適合作為組織工程椎間盤的種子細胞，而退變髓核細胞由于細胞活性較低，表型表達發(fā)生改變，不宜作為種子細胞。(2)TGF-β1和IGF-1對人正常髓核