去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架構(gòu)建組織工程髓核的研究.pdf

1、目的:
　　利用去污劑-核酸酶法脫細(xì)胞獲取去細(xì)胞髓核基質(zhì)，進(jìn)一步物理粉碎、溶解、離心、冷凍干燥成型、物理化學(xué)交聯(lián)、輻照消毒制備去細(xì)胞兔髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架;接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞至去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架，體外模擬椎間盤(pán)生理低氧環(huán)境，含TGF-β1培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)以獲取組織工程髓核;移植復(fù)合體至裸鼠皮下，觀察及評(píng)價(jià)復(fù)合體在體內(nèi)環(huán)境生長(zhǎng)情況。通過(guò)組織病理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)評(píng)價(jià)支架脫細(xì)胞情況及復(fù)合物內(nèi)細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)

2、胞外基質(zhì)分泌情況，通過(guò)生物力學(xué)評(píng)價(jià)支架及支架-種子細(xì)胞復(fù)合體的生物力學(xué)特性;通過(guò)肉眼觀察支架及復(fù)合體的宏觀結(jié)構(gòu)，掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)，并通過(guò)熒光定量分析樣本DNA總量評(píng)判細(xì)胞在支架內(nèi)的增殖情況，實(shí)時(shí)熒光定量分析聚集蛋白聚糖及二型膠原mRNA含量，綜合評(píng)價(jià)去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架的性能以及其應(yīng)用于髓核組織工程的可行性。
　　方法:
　　1.兔髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架的制備。選取36只2.5-3kg的新西蘭大白兔做為

3、髓核組織的供體來(lái)源，采用去污劑-核酸酶法對(duì)兔髓核組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理，根據(jù)課題組前期研究總結(jié)出的方案有效去除髓核細(xì)胞，且細(xì)胞外基質(zhì)成分損失較少。在原有脫細(xì)胞方案處理后進(jìn)行創(chuàng)新，進(jìn)一步將去細(xì)胞髓核基質(zhì)采用物理粉碎、溶解、離心、冷凍干燥成型、物理化學(xué)交聯(lián)、輻照消毒等一系列處理制得去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架。通過(guò)HE染色、DAPI染色判斷脫細(xì)胞程度，電鏡下觀察支架形態(tài)結(jié)構(gòu)、孔徑大小及空隙密度。通過(guò)吸水試驗(yàn)測(cè)定支架吸水率及孔隙率。通過(guò)配置不同

4、濃度支架浸提液及完全培養(yǎng)基（空白對(duì)照）培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞增殖情況判斷支架的細(xì)胞毒性。
　　2.接種骨髓間充干細(xì)胞至去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過(guò)添加TGF-β1等配置誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并將細(xì)胞-支架復(fù)合體置于5％O2，5％CO2的厭氧培養(yǎng)箱中分別誘導(dǎo)培養(yǎng)4天、2周、4周。肉眼觀察細(xì)胞-支架復(fù)合體大體形態(tài)變化;通過(guò)熒光定量法檢測(cè)復(fù)合體DNA總量以判斷細(xì)胞增殖情況;誘導(dǎo)培養(yǎng)后4天，電鏡觀察細(xì)胞-支架復(fù)合體

5、中細(xì)胞在支架上的黏附、增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況;通過(guò)活死細(xì)胞染色法觀察細(xì)胞在支架的存活情況;分別取出2周、4周組的細(xì)胞-支架復(fù)合體，通過(guò)HE染色、DAPI染色、阿利新蘭染色、二型膠原免疫組化染色等病理組織學(xué)技術(shù)，以及二型膠原、聚集蛋白聚糖mRNA實(shí)時(shí)熒光定量等分析體外培養(yǎng)復(fù)合體的形態(tài)變化，細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。
　　3.將部分在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后的細(xì)胞-支架復(fù)合體以及去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架（空白對(duì)照組）

6、移植入4周齡大小的裸鼠皮下肌膜層，取復(fù)合體移植4周后的裸鼠行活體成像檢測(cè);分別取出移植2周、4周的復(fù)合體樣本進(jìn)行觀察。包括通過(guò)肉眼觀察細(xì)胞-支架復(fù)合體大體形態(tài)變化;通過(guò)HE染色、DAPI染色、阿利新蘭染色、二型膠原免疫組化染色等病理組織學(xué)技術(shù)，以及二型膠原、聚集蛋白聚糖mRNA實(shí)時(shí)熒光定量分析等評(píng)價(jià)體內(nèi)移植物的形態(tài)變化，細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:去細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架的大體觀及基

7、本特征。肉眼觀見(jiàn)支架呈圓柱狀，乳白色，富有彈性，類似海綿，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)支架為多孔結(jié)構(gòu)，孔隙相互貫通，交界處結(jié)合緊密，中央脫細(xì)胞髓核基質(zhì)微絲相互連接，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)吸水試驗(yàn)測(cè)定的細(xì)胞吸水率為272.16±33.30％，孔隙率為81.28±4.10％。電鏡下孔隙相互貫通，空隙直徑在100-450um之間。HE染色結(jié)果顯示細(xì)胞外基質(zhì)淡紅染，細(xì)胞核及細(xì)胞殘留物去除較為徹底，DAPI染色顯示幾乎無(wú)細(xì)胞核殘留，表明脫細(xì)胞髓核基質(zhì)來(lái)源三維多孔

8、支架細(xì)胞去除徹底，擁有良好的三維立體結(jié)構(gòu)及理想的吸水率、空隙率及孔徑大小。
　　第二部分:體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-支架復(fù)合體的性能評(píng)估。肉眼下細(xì)胞-支架復(fù)合體隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，復(fù)合體體積縮小，質(zhì)地變得更加致密，2周左右形成一個(gè)實(shí)心圓餅狀的類髓核組織。掃描電鏡下觀察接種兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞4天的細(xì)胞-支架復(fù)合體，將支架橫行切割成2份，復(fù)合體表面及橫截面均可見(jiàn)細(xì)胞大量粘附在支架微絲結(jié)構(gòu)中，多數(shù)呈扁平狀，少數(shù)呈不規(guī)則型或圓形?；钏兰?xì)胞染

9、色觀察體外培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合體結(jié)果表明種子細(xì)胞在支架上存活良好，且分布均勻，死亡細(xì)胞極少;DNA熒光定量分析結(jié)果表明樣本DNA含量增加呈時(shí)間依賴性;將體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的復(fù)合體樣本切片HE染色、DAPI染色結(jié)果顯示種子細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加。阿利新藍(lán)染色、二型膠原免疫組化染色均表明隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞外特異性髓核基質(zhì)成分糖胺聚糖及二型膠原分泌逐漸增加。復(fù)合體及單純支架（空白對(duì)照）彈性模量顯示隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，復(fù)合

10、體彈性增加，但均與正常髓核彈性模量存在差異，其中培養(yǎng)4周后的復(fù)合體彈性接近正常。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明聚集蛋白聚糖及二型膠原mRNA分泌量呈時(shí)間依賴性增加。
　　第三部分:體內(nèi)種植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-支架復(fù)合體的性能評(píng)估。移植入裸鼠皮下肌膜的復(fù)合體樣本切片HE染色、DAPI染色結(jié)果顯示種子細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加。阿利新藍(lán)染色、二型膠原免疫組化染色均表明隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞外特異性髓核基質(zhì)成分糖胺聚糖

11、及二型膠原分泌逐漸增加。同樣實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明聚集蛋白聚糖及二型膠原mRNA分泌量呈時(shí)間依賴性增加。
　　結(jié)論:
　　1.骨髓間充干細(xì)胞來(lái)源穩(wěn)定，增殖快，可在含TGF-β1的誘導(dǎo)培養(yǎng)基及低氧環(huán)境中分化為類髓核細(xì)胞，并分泌大量髓核細(xì)胞外基質(zhì)，可以作為理想的種子細(xì)胞來(lái)源;2.利用去污劑-核酸酶法可以有效去除髓核細(xì)胞，且對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)損耗小，利用粉碎、冷凍干燥、物理化學(xué)交聯(lián)可以成功制備髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架，該支架具有

12、疏松多孔立體結(jié)構(gòu)，生物力學(xué)性能良好，無(wú)細(xì)胞毒性，且保留了大部分髓核細(xì)胞外基質(zhì)成分，可以作為髓核組織工程的支架來(lái)源;3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架，在低氧條件下，置于含TGF-β1誘導(dǎo)培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)，可成功向類髓核細(xì)胞分化、增殖;4.兔骨髓間充干細(xì)胞復(fù)合髓核去細(xì)胞基質(zhì)來(lái)源三維多孔支架裸鼠體內(nèi)種植，種子細(xì)胞在支架內(nèi)大量增殖，細(xì)胞分布均勻，部分形成簇狀結(jié)構(gòu)，且大量分泌合成髓核特異性基質(zhì)蛋白聚集蛋白聚糖及二型膠原，活體