低能離子注入雙酶產生菌Spj0104的誘變選育研究.pdf

1、合成、半合成抗生素的研究,是探索和開發(fā)新抗生素的最重要的途徑之一。而D-對羥基苯甘氨酸(D-pHPG)是半合成β-內酰胺類抗生素的重要前體,是目前制藥行業(yè)競爭激烈的產品之一,化學法制備D-pHPG帶來嚴重的污染和毒害,而酶法是較好的方法。酶法是利用D-海因酶(DHase)將苯海因(DL-pHPH)轉化為N-氨甲?；?D-對羥基苯甘氨酸(NC-D-pHPG),N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶(DCase)則繼續(xù)將NC-D-pHPG轉化為

2、D-pHPG。但現有的菌種產酶活力不高,故選育高產菌株提高酶活以及采用新技術提高酶利用率具有重要的研究價值。
　　 首先對出發(fā)菌株Spj0104的酶活水平進行了驗證,隨之開展低能N+離子注入技術的研究,對出發(fā)菌株運用單因子實驗以確定最佳能量與劑量,采用正交法對低能離子注入的參數進行了優(yōu)化,并在最優(yōu)條件下對于一次注入后誘變選育獲得的優(yōu)良菌株Spi03和經過微波誘變后的優(yōu)良菌株Sp902進行了二次離子注入。最后對于篩選到的高產菌株S

3、p208進行了發(fā)酵條件的優(yōu)化和遺傳穩(wěn)定性檢測。以下是整個實驗結果:
　　 (1)在顯微鏡下Spj0104呈短桿狀,生長周期比較長,在0～21h為生長延滯期；從21h開始,OD600迅速增加,直到57h,不再增大,且保持相對穩(wěn)定的狀態(tài),此為對數生長期；57～69h OD值相對穩(wěn)定,處于穩(wěn)定生長期。通過HPLC法測定經DHase和DCase催化后生成的終產物D-pHPG的含量,測定出該菌株的酶活為0.118955 u/mL。

4、　　 (2)在低能離子注入的準備工作中先要對待誘變的菌液風干處理。在30min時,菌膜完全干燥,至50min時,菌膜徹底干燥。隨著時間的增加,菌株由于缺乏水分和養(yǎng)料,致使存活率越來越低,所以當菌膜吹至30min時即可進行離子注入處理。
　　 (3)對低能N+離子注入的能量和劑量分別在固定了脈沖和間隔時間,多次不同劑量重復的前提下作了單因子實驗,確定了最適合的能量為30KeV。在30KeV能量條件下,設計了多梯度的劑量,不同劑量

5、下的存活率曲線為“馬鞍形曲線”。在馬鞍形曲線的“馬鞍”兩側選取了60×1014ions/cm2,80×1014ions/cm2,100×1014ions/cm2,120×1014ions/cm2,140×1014ions/cm2這幾個劑量,試驗結果綜合考慮酶活、存活率等幾個參數,確定最佳劑量為60×1014ions/cm2。在確定了最佳能量和劑量的基礎上,采用了四因素三水平的正交實驗,對能量、劑量、脈沖和間隔時間進行正交優(yōu)化設計。得出了

6、最適誘變參數為:能量20KeV,劑量40×1014ions/cm2,脈沖時間15S,間隔時間15S。
　　 (4)一次離子注入后篩選到一株優(yōu)良菌株Spi03,酶活達到了0.2422 u/mL。再將其在最佳離子注入條件下進行二次離子注入誘變,同時將經過微波誘變篩選到的菌株Sp902號進行離子注入處理,分別篩選到了.Sp208酶活為0.3271u/mL和Sp201酶活為0.2382u/mL,分別比原來提高了35.53％和28.41％

7、,
　　 經過微波和離子注入復合誘變的菌株在形態(tài)上變化很大,負突變株較多。從眾多的菌株中還篩選到一株菌株Sp206酶活為0.1536,雖然總酶活降低,但是DHase的酶活有較大的提高。
　　 (5)對發(fā)酵培養(yǎng)基成分作了正交實驗和分析,得出了優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為:玉米漿3.0％；葡萄糖1.5％；誘導劑3.0％；氯化鈉0.3％；(NH4)SO40.1％；MgSO40.05％；CoCl20.01％。對于影響發(fā)酵單位的發(fā)酵條件溫度