常壓室溫等離子誘變結(jié)合高通量篩選選育尿苷產(chǎn)生菌.pdf

1、尿苷廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品和醫(yī)藥行業(yè)，尤其作為多種抗病毒抗腫瘤藥物的中間體，具有極其重要的醫(yī)藥價(jià)值。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)尿苷具有諸多優(yōu)勢(shì)，但國(guó)內(nèi)尚無(wú)應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株。解除氨甲酰磷酸合成酶的反饋?zhàn)瓒艉头答佉种剖悄蜍漳軌虼罅糠e累的關(guān)鍵，因此誘變篩選尿苷酸結(jié)構(gòu)類似物突變株是一種選育尿苷產(chǎn)生菌的有效方法。此外，為了提高篩選效率，本文對(duì)尿苷產(chǎn)生菌的高通量篩選進(jìn)行了系統(tǒng)研究。
　　首先建立了常壓室溫等離子(ARTP)誘變和高通

2、量篩選(HTS)的方法:確立了ARTP作用的時(shí)間，摸索出了用96孔微孔板培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，并建立了用酶標(biāo)儀高通量檢測(cè)發(fā)酵液中尿苷濃度的方法。
　　以尿苷產(chǎn)生菌B.subtilis TD131為出發(fā)菌，經(jīng)ARTP處理以后，以不同濃度不同種類的尿苷酸結(jié)構(gòu)類似物作為初篩手段，逐步篩選抗尿苷酸結(jié)構(gòu)類似物突變株，再利用高通量篩選的方法篩選出其中的尿苷高產(chǎn)菌。最終獲得了四株尿苷產(chǎn)量顯著提高且產(chǎn)量性狀能夠穩(wěn)定遺傳的突變株，分別

3、命名為B.subtilis A219，B.subtilis A260，B.subtilis A566和B.subtilis F126。在未經(jīng)發(fā)酵工藝優(yōu)化的條件下，它們?cè)?L發(fā)酵罐上發(fā)酵尿苷的最終產(chǎn)量分別為12 g/L，14.5 g/L，16 g/L和18 g/L，是出發(fā)菌株的3.4倍，4.1倍，4.5倍和5.1倍，具備工業(yè)化應(yīng)用的潛力。
　　將篩選到的尿苷高產(chǎn)菌中嘧啶核苷操縱子基因進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)和出發(fā)菌株進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了氨甲酰