腦缺血再灌注DNA損傷與XRCC1的修復(fù)及褪黑素干預(yù)作用.pdf

1、在腦缺血再灌注過程中,產(chǎn)生氧自由基等毒性產(chǎn)物攻擊DNA和DNA損傷修復(fù)系統(tǒng),兩者共同參與腦缺血再灌注損傷的病理過程,保護(hù)DNA通?？梢詼p輕腦缺血再灌注損傷.腦缺血再灌注可擾亂腦的氧供和能量代謝,并在早期產(chǎn)生多種毒性產(chǎn)物,造成DNA損傷.如DNA堿基氧化和DNA斷裂.DNA斷裂包括DNA單鏈斷裂和DNA雙鏈斷裂,DNA雙鏈斷裂是凋亡的特征,DNA單鏈斷裂是可逆的,其轉(zhuǎn)歸是決定受損細(xì)胞命運(yùn)的"門檻".因此研究在腦缺血再灌注情況下的DNA單鏈

2、損傷的修復(fù)機(jī)制具有重要的理論和實踐意義.腦缺血再灌注后DNA損傷因子同時也是DNA修復(fù)蛋白的破壞因子,從而破壞保護(hù)DNA的"第二道防線".如在缺血再灌注早期APE/Ref-1、Ku70、Ku80迅速下降.提高DNA修復(fù)相關(guān)蛋白的水平可以減輕DNA的損傷.以上研究表明腦缺血再灌注DNA修復(fù)相關(guān)蛋白的表達(dá)下降是DNA損傷無法修復(fù)以至細(xì)胞死亡的重要機(jī)制.DNA蛋白X線修復(fù)交叉互補(bǔ)組1(XRCC1)是DNA單鏈損傷修復(fù)重要的蛋白,在腦缺血再灌注

3、中XRCC1與DNA單鏈損傷的關(guān)系未見研究.氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注DNA損傷與修復(fù)中發(fā)揮重要作用.研究表明抗氧化干預(yù)能夠減輕腦缺血再灌注損傷的程度.褪黑素(melatonin Mel)主要在松果體內(nèi)產(chǎn)生,是體內(nèi)抗氧化能力非常強(qiáng)的物質(zhì),為高效的自由基清除劑和間接的抗氧化劑.近來研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可能還參與DNA損傷修復(fù),褪黑素干預(yù)治療對于腦缺血再灌注XRCC1表達(dá)的影響情況尚不清楚,明確這些問題有利于豐富褪黑素對于腦缺血再灌注保護(hù)機(jī)制的認(rèn)識,

4、以便為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù).方法:選用250-300g健康雄性Wister大鼠,隨機(jī)分為三組:(1)假手術(shù)組(FO組),5只動物;(2)缺血再灌注組(IR組,大腦中動脈缺血2小時,按再灌注時間不同分為IR10min、1h、4h、12h、24h、48h組),每時相點(diǎn)5只動物;(3)褪黑素干預(yù)組(Mel組),每時相點(diǎn)5只動物.采用免疫組化和Western Blot檢測XRCC1的蛋白水平;利用單細(xì)胞凝膠電泳檢測DNA單鏈斷裂;用流式細(xì)胞儀檢

5、測神經(jīng)細(xì)胞凋亡;透射電子顯微鏡觀察褪黑素干預(yù)對腦缺血再灌注后超微結(jié)構(gòu)的影響.計量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析t檢驗,采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析.結(jié)果:(一)腦缺血再灌注DNA單鏈斷裂與XRCC1的修復(fù)作用.1.腦缺血再灌注10min 后,皮質(zhì)和基底節(jié)區(qū)DNA單鏈斷裂細(xì)胞輕度增加,12h達(dá)到高峰,一直到48h仍維持在較高的水平;基底節(jié)區(qū)DNA單鏈斷裂多于皮質(zhì)區(qū).2.腦缺血再灌注10min后,即出現(xiàn)凋亡細(xì)胞增多,

6、之后持續(xù)增加,24h達(dá)到高峰,48h仍較多;皮質(zhì)區(qū)凋亡細(xì)胞少于基底節(jié)區(qū).3.腦缺血再灌注10min基底節(jié)區(qū)XRCC1輕微下降,1h后在皮質(zhì)和基底節(jié)區(qū)XRCC1明顯下降,一直到48h仍維持在低水平.腦缺血再灌注各時相點(diǎn)皮質(zhì)區(qū)XRCC1多于基底節(jié)區(qū).假手術(shù)組在皮質(zhì)、基底節(jié)、海馬均有明顯表達(dá).(二)褪黑素對腦缺血再灌注DNA單鏈斷裂和XRCC1的影響.1.單細(xì)胞凝膠電泳觀察:褪黑素干預(yù)組在腦缺血再灌注各時相點(diǎn)DNA單鏈斷裂程度輕于腦缺血再灌注

7、組,但是沒有改變原變化趨勢.2.用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:與腦缺血再灌注組相比,褪黑素干預(yù)減輕腦缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡的程度.3.用免疫組化和West Blot方法結(jié)果顯示:與腦缺血再灌注組相比,褪黑素干預(yù)減少了XRCC蛋白下降的幅度.4.透射電子顯微鏡觀察:腦缺血再灌注組核膜皺縮,線粒體腫脹空泡樣變、髓鞘不規(guī)則,分層樣改變,膠質(zhì)細(xì)胞增生、有神經(jīng)細(xì)胞"被噬"現(xiàn)象.褪黑素干預(yù)神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞核膜輕度凹陷,整個核染色質(zhì)疏松,核周基質(zhì)較疏松,線粒