褪黑素對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、肝缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury IRI)主要發(fā)生于休克、肝部分切除及肝移植術(shù)中，尤其在肝移植中，已成為制約肝移植療效的重要因素之一。褪黑素(Melatonin，Mel)因其具有明顯的抗氧化及清除自由基作用，使其在IRI方面成為研究熱點。本研究以Mel為處理因素，探討Mel對大鼠肝IRI的保護(hù)作用，按時點采集標(biāo)本，對血清肝組織生化酶系：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性

2、磷酸酶(AKP)；肝組織勻漿抗氧化酶系：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH．px)及脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物丙二醛(MDA)進(jìn)行測定；對肝組織行HE染色及Caspase-3免疫組化染色，光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)改變；并在此基礎(chǔ)上通過電鏡觀察肝細(xì)胞核和細(xì)胞器的變化及凋亡情況，在亞細(xì)胞(蛋白表達(dá))水平上探討褪黑素對肝IRI保護(hù)作用及其機(jī)制。 材料與方法: 一、實驗材料 (一) 實驗分組72只體重在180g-22

3、0g，周齡在6-7周的健康雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為褪黑素處理組(Mel組)、酒精溶媒對照組(Alc組)和生理鹽水對照組(NS組)。 (二)動物模型制備參照Kobayashi法，用動脈夾夾閉肝門靜脈左支、肝動肝左支、左肝管45分鐘之后放開，建立大鼠肝左葉、中葉IRI模型，之后每組分別于再灌注后3h、6h、12h、24h采集標(biāo)本。 (三)藥品及給藥方式Mel組按Mel 20mg/kg體重于缺血前30分鐘腹腔注射給藥；溶

4、媒對照組采取與Mel組相同濃度的酒精溶液(4％)，生理鹽水對照組則注射同比例的生理鹽水。 (四)標(biāo)本采集及處理1、麻醉給藥方式及劑量麻醉采用10％水合氯醛于手術(shù)前10分鐘大鼠腹腔內(nèi)注射給藥，按0.3ml/100g體重給藥。第二次(取標(biāo)本時)采用相同的麻醉方法。 2、相關(guān)試劑組織病理及免疫組化染色標(biāo)本均采用4％甲醛固定：電鏡標(biāo)本則采用2.5％戊二醛固定；SOD、GSH．px、MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所：血生化相關(guān)試劑

5、購自德國寶靈曼公司；Mel 1g及Caspase-3試劑盒購自德國Merck公司3、相關(guān)儀器透射電子顯微鏡/光學(xué)顯微鏡及其照像系統(tǒng)/全自動生化分析儀/石蠟切片機(jī)/分光光度計/恒溫水浴/電磁攪拌器/離心機(jī)/超聲乳化機(jī)。 4、標(biāo)本的采集第一步：大鼠血清生化酶系第二步：大鼠肝組織氧化酶系第三步：大鼠肝臟形態(tài)學(xué)、免疫組化及電鏡取材 二、實驗方法 (一)血清肝組織生化酶系A(chǔ)LT、AST、AKP的測定 (二)肝組織SO

6、D、GSH．px、MDA的測定 (三)肝組織的病理學(xué)檢查 (四)Caspase．3免疫組織化學(xué)技術(shù)一ABC法 (五)透射電鏡觀察肝細(xì)胞 (六)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)檢驗免疫組化結(jié)果在400倍光鏡下觀察，計算每個高倍視野100個細(xì)胞中Caspase-3染色陽性細(xì)胞個數(shù)，每張切片計數(shù)10個視野，求出均值用x±S表示，得出陽性細(xì)胞率。所有數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計專業(yè)軟件SPSS 14.0進(jìn)行統(tǒng)計，組間比較采用方差分析，各組相互間

7、比較采用SNK檢驗，P<0.05為差異有顯著性。 一、大鼠血清肝生化酶系 (一)ALT含量 ALT在再灌注后各時點的Mel組均顯著低于Alc及NS對照組(P<0.05)，且Alc組與NS組相比無顯著性差異。 (二)AST含量 AST在再灌注后各時點的Mel組均顯著低于Alc及NS對照組(P<0.05)，且各時點內(nèi)Alc組與NS組相比無顯著性差異。 (三)AKP含量 AKP在再灌注后

8、6h、12h、24h時點的Mel組均顯著低于Alc及NS對照組(P<0.05)，且各時點內(nèi)Alc組與NS組相比無顯著性差異。 二、大鼠肝組織抗氧化酶系及丙二醛 (一)SOD含量 SOD在再灌注后3h、12h、24h時點的Mel組顯著高于Alc及NS對照組(P<0.05)，在再灌注后6h時點的Mel組顯著高于Alc對照組，且各時點內(nèi)Alc組與NS組相比無顯著性差異。 (二)GSH.px含量 GSH．

9、px在再灌注后各時點的Mel組均顯著高于Alc及NS對照組(P<0.05)，且各時點內(nèi)Alc組與NS組相比無顯著性差異。 (三)MDA含量 MDA在再灌注后各時點的Mel組均顯著低于Alc及NS對照組(P<0.05)，且各時點內(nèi)Alc組與NS組相比無顯著性差異。 三、大鼠肝組織Caspase-3免疫組化染色 Mel組再灌注后各時點的Caspase-3染色陽性細(xì)胞率均顯著低于對照組(Alc組和NS組)(P<

10、0.05)，且各時點內(nèi)的Alc組與NS組相比無顯著性差異。 四、大鼠肝組織HE染色 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在再灌注后各時點的。Mel處理組的肝細(xì)胞變性、壞死的程度與范圍，肝索結(jié)構(gòu)的破環(huán)程度與范圍均明顯輕于對照組(Alc組及NS組)。 五、大鼠肝組織透射電鏡觀察 結(jié)果對照組(Alc組及NS組)在6及12小時時發(fā)現(xiàn)了普遍的肝細(xì)胞調(diào)亡現(xiàn)象，在24小時．Alc組及NS組標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了較典型的晚期凋亡現(xiàn)象，相同時點Mel組則很少發(fā)