基于去唾液酸糖蛋白受體的循環(huán)肝癌細胞分離-檢測系統(tǒng)及其臨床應(yīng)用研究.pdf

1、目的：肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者體內(nèi)的循環(huán)腫瘤細胞(circulatingtumor cells，CTCs)，即循環(huán)肝癌細胞，是HCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。檢測循環(huán)肝癌細胞對于預(yù)測HCC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)無疑具有重要臨床意義。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測HCC患者外周血中甲胎蛋白(alpha-f

2、etoprotein，AFP)mRNA從而檢測HCC患者CTCs的報道較多。然而，RT-PCR法有其固有局限，如易產(chǎn)生假陽性和假陰性、操作難以標準化、不能準確估算樣本中CTC的數(shù)目等。此外，更不可忽視的是，RT-PCR法須破壞細胞形態(tài)，不能對單個CTC進行觀察、分析和計數(shù)，而這些數(shù)據(jù)可提供CTCs惡性程度和侵襲性方面的信息。因此迫切需要建立特異和敏感的循環(huán)肝癌細胞分離和檢測技術(shù)。
　　 目前分離CTCs的標準方法是基于腫瘤細胞表

3、面上皮性抗原的磁性激活細胞分選技術(shù)(magnetic-activated cell separation，MACS)。由于缺乏針對肝癌細胞表面特異性抗原的單克隆抗體，迄今鮮見MACS用于分離循環(huán)肝癌細胞的報道。基于上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)抗體磁珠的CellSearch系統(tǒng)己被美國FDA批準用于檢測乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌CTCs。盡管肝癌細胞屬于上皮性細胞，但Ep

4、CAM僅在約35％左右的HCC組織標本中表達。因此，CellSearch系統(tǒng)并不適合用于分離、檢測循環(huán)肝癌細胞。
　　 去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)是一種特異表達于肝實質(zhì)細胞表面的跨膜蛋白，能結(jié)合和內(nèi)吞以半乳糖基和N-乙酰半乳糖胺基為端基的分子。這一特性己被用于設(shè)計多種實驗研究。比如，利用放射性核素標記這樣的糖蛋白，選擇性地與肝細胞膜上的ASGPR相結(jié)合，可以進行肝顯像

5、；而以這樣的糖蛋白為載體將抗腫瘤藥物、降膽固醇藥物、甚至治療基因?qū)蚋螌嵸|(zhì)細胞，則是藥物肝靶向遞送的一個重要研究命題。利用這一個特性，本課題創(chuàng)建了一種基于ASGPR的磁性分選和肝細胞特異性抗體Hep Par1免疫鑒定的循環(huán)肝癌細胞分離/鑒定系統(tǒng)，即以生物素化去唾液酸胎球蛋白作為配體與肝癌細胞結(jié)合，然后用抗生物素抗體磁珠進行間接磁性標記，從而磁性捕獲循環(huán)肝癌細胞，接著用Hep Par1抗體進行免疫熒光染色鑒定，并對陽性細胞進行計數(shù)。由于肝

6、細胞通常不會脫落進入血循環(huán)，除非演變成腫瘤細胞，因此檢測到的細胞即為循環(huán)肝癌細胞。該系統(tǒng)解決了以前所報道方法的固有問題，具有高度的特異性和敏感性。通過利用該系統(tǒng)對HCC患者、良性肝病患者和健康志愿者臨床樣本的檢測，探討了該系統(tǒng)臨床應(yīng)用的可行性。
　　 方法：
　　 1、采用生物素化試劑Sulfo-NHS-lC-Biotin和去唾液酸胎球蛋白制備生物素化去唾液酸胎球蛋白，并進行離心超濾純化。
　　 2、采用流式細胞

7、術(shù)驗證生物素化去唾液酸胎球蛋白與肝癌細胞的結(jié)合活性及確定最佳工作濃度。
　　 3、采用流式細胞術(shù)分析生物素化去唾液酸胎球蛋白與肝癌細胞結(jié)合的特異性。
　　 4、采用生物素化去唾液酸胎球蛋白、抗生物素抗體磁珠進行間接磁性標記肝癌細胞，通過磁場分離肝癌細胞。
　　 5、采用肝細胞特異性抗體Hep Par1進行免疫熒光染色，鑒定和計數(shù)分選到的肝癌細胞。
　　 6、通過Hep3B細胞摻入試驗分析所建立的循環(huán)肝癌細

8、胞分離/檢測系統(tǒng)的回收率、特異性和敏感性。
　　 7、通過Hep3B細胞摻入試驗比較基于生物素化去唾液酸胎球蛋白/抗生物素抗體磁珠的循環(huán)肝癌細胞分離方法與基于EpCAM抗體磁珠的分離方法的回收率。
　　 8、采用所建立的循環(huán)肝癌細胞分離/檢測系統(tǒng)檢測各種患者5 mL外周血樣本中的CTCs。包括：235例不同分期的HCC患者、20例健康志愿者、37例良性肝病患者(包括16例肝硬化、4例慢性乙型肝炎、6例急性甲型肝炎、8例肝

9、海綿狀血管瘤和3例肝囊腫患者)以及19例其他5種類型晚期腫瘤患者(包括3例睪丸癌、4例甲狀腺癌、4例結(jié)腸癌、3例腎癌和5例乳腺癌患者)。
　　 9、采用所建立的循環(huán)肝癌細胞分離/檢測系統(tǒng)檢測11例良性肝占位性病變患者(包括8例肝海綿狀血管瘤、3例肝囊腫)手術(shù)切除后第1天、第4天、第7天、第10天和第14天的CTCs。
　　 10、采用CK3-6H5抗體和TUNEL法雙染鑒定HCC患者外周血中凋亡的CTCs。
　　

10、 11、采用CD133抗體進行免疫熒光染色鑒定HCC患者外周血中具有肝癌干細胞表型的CTCs。
　　 12、采用Spearman相關(guān)分析、Fisher's確切概率法和Mann-Whitney檢驗，分析CTCs陽性率以及CTCs數(shù)目與HCC患者臨床特征的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1、流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，生物素化去唾液酸胎球蛋白與肝癌細胞的反應(yīng)活性好，其最佳工作濃度為0.4 mg/mL。
　　 2、流式細

11、胞術(shù)結(jié)果顯示，生物素化去唾液酸胎球蛋白與肝癌細胞的結(jié)合具有高度特異性。
　　 3、Hep3B細胞摻入試驗顯示，5 mL健康志愿者外周血中分別摻入10、30、90、270和810個Hep3B細胞，在每個摻入水平，Hep3B細胞的平均回收率均≥61％，并且在只摻入10個細胞的所有5個樣本中，沒有1個樣本檢測到的腫瘤細胞數(shù)少于5個。
　　 4、在摻入MCF-7人乳腺癌細胞和A498人腎癌細胞的所有標本中，均無細胞角蛋白陽性細胞

12、檢出。
　　 5、Hep3B細胞摻入試驗顯示，生物素化去唾液酸胎球蛋白/抗體生物素抗體磁珠回收率顯著高于EpCAM抗體磁珠(P＜0.05)。
　　 6、20例健康志愿者、37例良性肝病患者以及19例其他5種類型晚期腫瘤病例的5mL外周血樣本中均未檢出CTCs。
　　 7、11例良性肝占位性病變(包括8例肝海綿狀血管瘤、3例肝囊腫)術(shù)前無1例檢出CTCs，手術(shù)后第1天、第4天、第7天和第10天可檢測到Hep Par

13、1陽性細胞，且第1天、第4天、第7天和第10天檢出的Hep Par1陽性細胞數(shù)依次逐漸減少，而第14天則全部病例均檢測不到CTCs。
　　 8、235例HCC患者中，CTCs陽性率為83％(195/235)，CTCs檢出數(shù)范圍0-153個/5 mL外周血，均數(shù)為21±25個。
　　 9、部分HCC患者外周血中檢出CD133陽性的CTCs。
　　 10、HCC患者的CTCs中有一部分是凋亡的CTCs。
　　

14、 11、統(tǒng)計分析顯示，在受檢的235例HCC患者中，CTCs陽性率和CTCs數(shù)目與腫瘤大小、門靜脈癌栓、TNM分期、Milan標準符合情況具有顯著相關(guān)性，但與年齡、性別、病因、Child-Pugh分級和血清AFP濃度均無相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 本研究創(chuàng)建了一種獨特的基于ASGPR及其配體相互作用的循環(huán)肝癌細胞磁性分離方法，結(jié)合基于肝細胞特異性抗體Hep Par1的免疫熒光染色鑒定方法，形成了一種新穎的循環(huán)肝癌細胞分