魚卵唾液酸糖蛋白調控成骨細胞和破骨細胞分化及作用機制的研究.pdf

1、正常成年人的骨代謝是一個動態(tài)平衡的過程,包括成骨細胞進行的骨形成和破骨細胞進行的骨吸收。當此平衡失調,骨吸收大于骨形成時,即導致骨質疏松。魚卵中含有豐富的蛋白質、EPA、DHA、維生素和礦物質等營養(yǎng)成分,具有防治心血管疾病、改善學習能力、促進兒童的生長發(fā)育等多種功效。魚卵作為主要加工副產物,對其研究主要集中于其功能脂質的開發(fā)和利用,且對魚卵糖蛋白的研究還集中于其分離純化、生化特性等方面,對其活性研究甚少。因此本實驗從鯽魚魚卵中經脫脂、水

2、提獲得水溶性唾液酸糖蛋白,從細胞水平系統(tǒng)的研究了鯽魚卵唾液酸糖蛋白(Carassius auratus sialyglycoproteins,Ca-SGP)促進骨形成和抑制骨吸收功能的作用及機制,主要研究結果如下:
　　采用 DAD/FLD串聯(lián) HPLC法檢測不同水產動物水溶性糖蛋白的唾液酸含量,并用 MC3T3-E1成骨細胞對其增殖活性進行追蹤。結果顯示,不同水產動物卵水溶性糖蛋白唾液酸含量與其促進 MC3T3-E1成骨細胞的增

3、殖活性呈正相關關系,無脊椎動物魷魚卵中不含唾液酸,其水溶性糖蛋白對 MC3T3-E1成骨細胞的增殖沒有影響。其中鯽魚卵水溶性糖蛋白中唾液酸含量最高,達3.76％,其促進MC3T3-E1成骨細胞增殖率也最大,400μg/mL時達153.57%,具有時間和劑量效應關系。故后續(xù)實驗以鯽魚卵唾液酸糖蛋白為研究對象。
　　為了探究鯽魚卵唾液酸糖蛋白對 MC3T3-E1成骨細胞活性的影響及其作用機制,本文將鯽魚卵唾液酸糖蛋白經截留分子量為10

4、KDa的中空纖維膜超濾分段,得分子量大于10KDa和小于10KDa的兩個鯽魚卵唾液酸糖蛋白,以MC3T3-E1成骨細胞為研究對象,采用 MTT法研究了不同分子量 Ca-SGP對MC3T3-E1成骨細胞增殖的影響,結果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能顯著促進MC3T3-E1成骨細胞的生長(96h時增殖率分別為153.57%和137.28%);采用ELISA方法檢測兩種Ca-SGP對MC3T3-E1成骨細胞分化的影響,結果表

5、明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能顯著促進成骨細胞分化關鍵蛋白ALP、OCN和COL I的分泌量,從而促進MC3T3-E1成骨細胞的分化;采用茜素紅染色法檢測不同分子量Ca-SGP對MC3T3-E1成骨細胞礦化的影響,結果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均對成骨細胞礦化結節(jié)的形成具有促進作用,分別提高了196.41%和158.37%(P<0.01);采用 RT-PCR和 Western blotting法研究了兩

6、種Ca-SGP對MC3T3-E1成骨細胞骨形成關鍵基因BMP-2、OPG和RANKL mRNA和蛋白表達的影響,其中RANKL和OPG在調控破骨細胞分化中發(fā)揮重要作用, RANKL可促進破骨細胞的分化,而OPG可阻斷RANKL的促進作用,從而抑制破骨細胞的分化,結果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能顯著上調BMP-2和OPG mRNA和蛋白的表達,下調RANKL mRNA和蛋白的表達。提示,Ca-SGP可能是通過提高 OP

7、G/RANKL的比值水平,而達到促進成骨細胞的分化及骨形成的功能,且Ca-SGP(>10KDa)的效果優(yōu)于Ca-SGP(<10KDa)。
　　為了進一步研究鯽魚卵唾液酸糖蛋白對破骨細胞分化功能的影響及其作用機制,本文采用M-CSF和RANKL體外誘導小鼠骨髓細胞分化為成熟破骨細胞,建立破骨細胞模型,系統(tǒng)研究Ca-SGP對破骨細胞增殖和分化的影響并探究其作用機制。MTT法和LDH試劑盒法實驗結果表明,兩種Ca-SGP對破骨細胞前體細

8、胞及破骨細胞增殖及細胞毒性均無顯著性影響;抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色法及TRAP活性檢測結果表明>10KDa和<10KDa的Ca-SGP均能夠呈時間劑量依賴性的抑制小鼠骨髓造血細胞向破骨細胞的分化,且分化早期抑制作用最強;促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌量升高可促進破骨細胞的分化,ELISA法檢測結果表明,>10KDa和<10KDa的Ca-SGP可顯著抑制破骨細胞促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的合成。提

9、示鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制破骨細胞的分化及促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的作用,且與其細胞毒性無關。
　　破骨細胞分化機制簡單介紹如下:成骨細胞分泌的RANKL與破骨細胞表面的RANK結合,促進TRAF6與其在RANK上的結合位點結合,從而促進NF-κB、MAPK通路關鍵基因的激活,進而上調核轉錄因子c-fos和NFATc1的表達水平,此通路被激活后,引起破骨細胞分化關鍵基因TRAP、MMP-9、CTR、組織蛋白

10、酶 K的表達升高,從而介導破骨細胞的分化,因此成骨細胞對破骨細胞的調控至關重要。本實驗研究結果表明,兩種 Ca-SGP均能抑制破骨細胞分化通路中TRAF6、NF-κB、MAPK(p38、ERK、JNK)和核轉錄因子c-fos、NFATc1以及TRAP、MMP-9、CTR、組織蛋白酶K的mRNA表達水平;且TRAF6、c-fos、NFATc1、TRAP、MMP-9、CTR、組織蛋白酶 K的蛋白表達水平也顯著降低, NF-κB以及MAPK(

11、p38、ERK、JNK)蛋白磷酸化水平也明顯下降。提示Ca-SGP可能通過抑制 NF-κB/MAPK/NFATc1通路基因的表達而發(fā)揮抑制破骨細胞分化的作用,且與成骨細胞的調控息息相關。
　　綜上所述,鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著促進成骨細胞的分化及骨形成功能、抑制破骨細胞的分化,其作用機制可能是通過上調MC3T3-E1成骨細胞中OPG的表達,下調RANKL的表達,從而抑制破骨細胞分化相關通路NF-κB/MAPK/NFATc1的激活。