河北省腎綜合征出血熱主要流行區(qū)漢坦病毒的基因變異研究.pdf

1、目的:了解河北省腎綜合征出血熱(HFRS)主要流行區(qū)疫情變化特征，研究該地區(qū)宿主動(dòng)物所攜帶漢坦病毒(HV)基因型別和隨時(shí)間基因變異情況，指導(dǎo)對(duì)本病的預(yù)防和控制。
　　方法:
　　1、收集1996-2013年河北省HFRS主要流行區(qū)疫情資料，總結(jié)HFRS主要流行區(qū)宿主動(dòng)物的密度、帶毒率和鼠種構(gòu)成等流行病學(xué)資料變化特征。
　　2、夾夜法捕鼠，無菌取鼠肺，用冷凍切片機(jī)切鼠肺，冷丙酮固定，間接免疫熒光法(IFA)篩選HV陽性鼠

2、肺。
　　3、從陽性鼠肺和保存毒株中提取總RNA，應(yīng)用熒光定量PCR進(jìn)行基因分型。
　　4、RT-PCR法擴(kuò)增G1、G2部分片段及全M基因片段，全M基因片段的產(chǎn)物純化后經(jīng)TA克隆連接入pMD19-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化入DH5α菌。
　　5、篩選陽性重組質(zhì)粒，提取后測(cè)序，用DNAStar軟件進(jìn)行序列拼接后，用分子進(jìn)化方法和軟件分析病毒核苷酸和氨基酸的同源性，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，對(duì)河北省主要流行區(qū)鼠攜帶HV的核苷酸變異及特征進(jìn)行

3、分析。
　　6、應(yīng)用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1、河北省東北部唐山和秦皇島市自2001年以來，HFRS發(fā)病率明顯高于河北省其他地市，2008年兩地市HFRS病例大幅攀升，于2013年達(dá)河北省HFRS病例總數(shù)的90％，目前是我省HFRS的主要流行區(qū)。
　　2、唐山市和秦皇島市2004-2013年平均鼠密度為2.26％，其中居民區(qū)為2.75％，野外為1.16％，二者有逐年上升的趨勢(shì)。兩地市平均鼠帶

4、毒率為10.29％，其中居民區(qū)為11.23％，野外為2.96％。居民區(qū)與野外鼠密度、帶毒率總體均有顯著性差異。
　　唐山和秦皇島市2009-2013年鼠類種群構(gòu)成經(jīng)分類鑒定，居民區(qū)和野外的主要優(yōu)勢(shì)鼠種都是褐家鼠，但居民區(qū)與野外的鼠種構(gòu)成具有顯著性差異。
　　3、對(duì)河北省HFRS主要流行區(qū)IFA陽性鼠肺及毒株采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行分型擴(kuò)增，結(jié)果顯示21份陽性標(biāo)本所攜帶HV均為SEO型，未發(fā)現(xiàn)HTN型。
　　4、選擇研

5、究需要有代表性標(biāo)本擴(kuò)增G1、G2基因片段并測(cè)序，共獲得13個(gè)G1片段和14個(gè)G2片段序列。HV G1(217-573nt)基因核苷酸同源性為95.5％-100％，其中93HBQ3、93HBQ4和HBQ17/2012比較分別為95.5％、95.8％，TS-2/2004和HBQ20/2007比較為100％，HBT49/2013和HBT50/2013比較也為100％。與R22株進(jìn)行比較，同源性較高，為94.5％-96.3％，與76-118株的

6、同源性較低，僅為69.9％-71.8％。HV G2(2002-2301nt)基因核苷酸序列同源性比較結(jié)果表明，同源性高達(dá)97.4％-100％，其中93HBQ3、93HBQ4和HBQ5/2012的同源性均為97.4％，HBQ7/2013和HBQ17/2012的同源性為100％，以及TS-2/2004、HBQ20/2007和HBQ43/2009比較同源性均為100％。與R22株和76-118株的同源性比較分別為90.8％-92.7％和71.

7、3％-72.6％?？梢娡椭gM片段的基因序列相對(duì)比較保守，提示HV沒有發(fā)生較大的基因變異。
　　5、根據(jù)G1(217-573nt)和G2(2002-2301nt)片段用DNAStar軟件包構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。G1片段進(jìn)化樹顯示QHD-1/2004、TS-2/2004、HBT-3/2012、HBT14/2012、HBT49/2013、HBT50/2013、HBQ20/2007、HBQ43/2009、HBQ5/2012、HBQ17/20

8、12、HBQ7/2013株與BjHD01株在同一支，親緣關(guān)系較近，93HBQ3、93HBQ4和ZT71、changchun株在同一分支，親緣關(guān)系較近，均屬于SEO型病毒的S3亞型。G2片段系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，93HBQ3、93HBQ4和ZT71、ZT10株在同一分支，親緣關(guān)系較近，TS-2/2004、HBT67/2011、HBT69/2011、HBT-3/2012、HBT14/2012、HBT49/2013、HBT50/2013、HBQ20

9、/2007、HBQ43/2009、HBQ5/2012、HBQ17/2012、HBQ7/2013株與cp27c株在同一支，親緣關(guān)系較近。14份標(biāo)本均在同一大的分支，即SEO型病毒的S3亞型。結(jié)果顯示雖同在S3亞型，但93HBQ3、93HBQ4與其它株系統(tǒng)提示已發(fā)生明顯變化。
　　6、建立了從鼠肺直接擴(kuò)增全M基因片段的方法，成功構(gòu)建了M基因片段的重組質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)序共獲得11個(gè)M片段全序列，結(jié)果顯示M基因片段全長3651nt，由5'非編碼

10、區(qū)、開放閱讀框以及3'非編碼區(qū)三部分組成。5'和3'非編碼區(qū)的長度分別為47nt、203nt。只存在一個(gè)全長為3402nt的完整開放閱讀框，編碼1133個(gè)氨基酸的病毒蛋白前體。與其他HV一樣，M基因片段的RNA其3'和5'末端反向互補(bǔ)，形成鍋柄狀二級(jí)結(jié)構(gòu)。
　　7、11株病毒標(biāo)本之間核苷酸同源性為95.8％-99.8％，其中93HBQ3和93HBQ4與其他9株病毒核苷酸同源性為95.8％-97.0％。而93HBQ3和93HBQ4兩

11、株病毒之間的同源性為98.7％，其他9株病毒之間核苷酸同源性高達(dá)98.6％-99.8％。且11份標(biāo)本均與SEO型HV的毒株(R22、L99、BjHD01、Z37)核苷酸的同源性較高，在83.6％-99.2％之間，與HTN型(Q32、Lee、76-118)核苷酸同源性較低，僅為70.0％-71.7％。進(jìn)一步提示HV沒有發(fā)生較大的基因變異。
　　8、M片段構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示HBT-3/2012、HBT14/2012、HBT49/2013

12、、HBT50/2013、HBQ20/2007、HBQ43/2009、HBQ5/2012、HBQ17/2012、HBQ7/2013株與BjHD01在同一小支，親緣關(guān)系較近，93HBQ3、93HBQ4和Z37、ZT10在同一小支，親緣關(guān)系較近，但11份標(biāo)本與上述參考毒株均在同一分支，均屬于S3亞型，而與76-118、Lee、 Q32親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。G1、G2基因部分片段系統(tǒng)進(jìn)化樹分型結(jié)果與M基因全序列分型結(jié)果一致。
　　結(jié)論:
　

13、　1、唐山和秦皇島市是河北省HFRS的主要流行區(qū)，近幾年疫情呈上升趨勢(shì)。褐家鼠是該地區(qū)的優(yōu)勢(shì)鼠種，并且是HFRS的主要傳染源。
　　2、河北省HFRS主要流行區(qū)宿主動(dòng)物所攜帶的HV基因型為SEO型，基因亞型為S3亞型。
　　3、河北省HFRS主要流行區(qū)鼠攜帶HV基因未發(fā)生較大變異，同型之間M片段序列相對(duì)較保守，但同一亞型內(nèi)不同病毒株存在明顯變異。
　　4、短期時(shí)間內(nèi)HV的基因變異不大，但長期時(shí)間HV基因變異會(huì)有顯著變化