水稻抗白葉枯病相關(guān)基因的功能鑒定及入門(mén)載體的改進(jìn).pdf

1、水稻白葉枯病是一種由白葉枯病菌引起的細(xì)菌性病害，已嚴(yán)重影響到了水稻的品質(zhì)與產(chǎn)量。克隆抗病基因，培育抗病品種才是經(jīng)濟(jì)有效的防治水稻白葉枯病方法。
　　本研究克隆了22個(gè)水稻抗白葉枯病相關(guān)基因。其中4個(gè)基因是通過(guò)酵母雙雜篩選出的抗病相關(guān)基因，另外18個(gè)基因是對(duì)Y73接種白葉枯病菌后篩選出的抗病相關(guān)基因。Xa5是水稻感病抗病過(guò)程中的一個(gè)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)節(jié)點(diǎn)；x a5是一個(gè)已知的抗病基因，它的抗病功能是由于其編碼的蛋白與Xa5有一個(gè)氨基酸的差

2、異；OmXa5是疣粒野生稻中Xa5的等位基因，而且它編碼的蛋白與Xa5、xa5均有差異。為了研究這22個(gè)基因的功能及它們與水稻抗白葉枯關(guān)鍵基因Xa5、xa5、OmXa5之間的互作關(guān)系，我們進(jìn)行了一系列的研究。
　　22個(gè)互作候選基因分別與Xa5、xa5、OmXa5進(jìn)行BiFC（雙分子熒光互補(bǔ)）互作鑒定后發(fā)現(xiàn)：Xa5與過(guò)氧化氫同工酶(Os02g0115700)、類(lèi)組蛋白(Os05g0461400)互作發(fā)生在細(xì)胞核上，與類(lèi)泛素蛋白(O

3、s09g0420800)互作同時(shí)發(fā)生在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜上，與其余的19個(gè)候選基因互作時(shí)沒(méi)有觀(guān)察到熒光信號(hào)；OmXa5與這22個(gè)候選基因的互作模式和 Xa5相同；xa5與過(guò)氧化氫同工酶(Os02g0115700)、類(lèi)組蛋白(Os05g0461400)互作發(fā)生在細(xì)胞核上，與類(lèi)泛素蛋白(Os09g0420800)和其余19個(gè)候選基因互作時(shí)沒(méi)有觀(guān)察到熒光信號(hào)，可見(jiàn)xa5與這22個(gè)候選基因的互作模式與Xa5不同。我們推測(cè)類(lèi)泛素蛋白(Os09g04

4、20800)、過(guò)氧化氫同工酶(Os02g0115700)、類(lèi)組蛋白(Os05g0461400)這三個(gè)蛋白可能是水稻抗病相關(guān)途徑中的重要調(diào)控因子；OmXa5的功能與Xa5相似，其突變的氨基酸可能對(duì)蛋白的功能無(wú)影響。
　　利用亞細(xì)胞定位技術(shù)對(duì)22個(gè)互作候選基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了分析，為這些基因的功能研究提供了重要信息。22個(gè)候選基因中5個(gè)基因的sGFP融合蛋白定位于細(xì)胞核上，可能發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄因子的功能；5個(gè)基因的s GFP融合蛋白定位于細(xì)

5、胞質(zhì)膜上，推測(cè)其功能可能是在細(xì)胞質(zhì)膜上調(diào)控物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；6個(gè)基因的sGFP融合蛋白同時(shí)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)膜上；另外還有6個(gè)基因的s GFP融合產(chǎn)物亞細(xì)胞定位時(shí)沒(méi)有觀(guān)察到熒光定位信號(hào)。
　　在進(jìn)行互作鑒定及亞細(xì)胞定位觀(guān)察時(shí)，我們采用的是快速靈活的Gate way重組技術(shù)。但在構(gòu)建入門(mén)載體時(shí)較低的線(xiàn)性化效率和連接效應(yīng)影響了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展。于是我們對(duì)現(xiàn)有的入門(mén)載體構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，用內(nèi)切酶BciVI來(lái)線(xiàn)性化入門(mén)載體。BciVI線(xiàn)性化載體的效率

6、要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于XcmI，且在測(cè)試實(shí)驗(yàn)中用BciVI線(xiàn)性化的T載體連接基因片段后陽(yáng)性克隆數(shù)也比XcmI多出大約40％。長(zhǎng)度在2000 bp內(nèi)的PCR片段都可以高效的連接到BciVI線(xiàn)性化后的T載體（大約50%的克隆中目的基因片段都以期望的方向連入了入門(mén)載體）。隨著片段長(zhǎng)度的增加克隆數(shù)和克隆陽(yáng)性率雖有下降，但最大仍可連入長(zhǎng)度為4700 bp的基因片段。改進(jìn)后的入門(mén)載體構(gòu)建方法具有穩(wěn)定高效的特點(diǎn)，將來(lái)可以用來(lái)更加高效的構(gòu)建Gate way入門(mén)載體