負性共刺激分子B7-H1在A2B5陽性人腦膠質瘤干細胞樣細胞中的負性調控作用探討.pdf

1、[目的]
　　體外培養(yǎng)腦膠質瘤細胞，從中分離鑒定腦腫瘤干細胞樣細胞(brain tumor stem-like cells，BTSCs)；觀察BTSCs的生物學特性，包括形態(tài)學、單克隆形成率、增殖曲線、成瘤能力以及分化能力；通過多種方法比較負性共刺激分子B7-H1在BTSCs和非BTSCs中的表達；體外實驗觀察BTSCs的免疫學特性，以及是否較非BTSCs更利于通過B7-H1途徑逃逸機體的免疫監(jiān)控。
　　[方法]
　　

2、用無血清培養(yǎng)液(含EGF、bFGF和B27)培養(yǎng)6例原代膠質母細胞瘤和1例人腦膠質瘤細胞系U87，觀察其在不同培養(yǎng)條件下(無血清和含血清培養(yǎng))的生長特性。流式細胞術檢測無血清培養(yǎng)條件下的原代膠質母細胞瘤A285和CD133的表達率。用流式細胞儀分選無血清培養(yǎng)的U87和原代膠母細胞，將其分為A285陽性細胞群和A285陰性細胞群，比較兩群細胞在無血清培養(yǎng)條件下的生長形態(tài)；單克隆形成實驗和XTT法比較這兩群細胞以及未分選膠母細胞的增殖能力：

3、免疫熒光法鑒定干細胞標志物的表達以及血清培養(yǎng)液誘導分化后的分化標志物的表達；裸鼠腹股溝皮下注射觀察兩群細胞的成瘤能力，以鑒定BTSCs。
　　分別用免疫熒光法、Western Blot法和流式細胞術檢測負性共刺激分子B7-H1在6例原代膠質母細胞瘤分選后得到的A285陽性細胞群和A285陰性細胞群中的表達情況，并比較兩者的差別；用流式雙標法檢測U87細胞系以及本實驗室長期培養(yǎng)的SHG62、SHG66細胞系A285和B7-H1的表達

4、情況，并比較B7-H1在長期離體培養(yǎng)條件下的A285陽性細胞群和A285陰性細胞群中表達情況的差別。
　　將原代膠質母細胞瘤分選后得到的A285陽性細胞群和A285陰性細胞群分別制備抗原；提取患者自體外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)，其中的貼壁細胞經GM-SF和IL-4刺激誘導上調樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)比例，分別加入上述兩群抗原后獲得

5、成熟DCs，之后與來自PBMCs的非貼壁細胞共培養(yǎng)獲得活化的效應細胞(即cytotoxic T lymphocytes，CTLs)，然后分多組用CSFE/PI法進行殺傷實驗、XTT法進行特異性T細胞增殖實驗，比較A285陽性細胞群和A285陰性細胞群的免疫學特性、以及對B7-H1進行干預前后各組實驗結果的差別。將未分選的人膠質母細胞瘤細胞系U87在三種條件下培養(yǎng)：1)有血清貼壁培養(yǎng)；2)無血清懸浮培養(yǎng)；3)放化療干預條件下無血清懸浮培養(yǎng)

6、。分別檢測對B7-H1進行干預前后T細胞對各組細胞殺傷率的差別。
　　[結果]
　　原代膠質母細胞瘤在無血清培養(yǎng)條件下部分呈懸浮生長形成腫瘤球、部分呈貼壁生長；U87細胞在無血清培養(yǎng)條件下呈懸浮生長。原代腦膠質瘤細胞經流式分選后得到的A2B5陽性細胞呈懸浮生長，并形成腫瘤球；A2B5陰性細胞亦呈懸浮生長，但極少能形成腫瘤球。單克隆形成實驗發(fā)現5.73％±0.64％的A2B5陽性細胞能形成單細胞克隆球、未分選的細胞有3.01％

7、±0.50％能形成單細胞克隆球、而A2B5陰性細胞的單克隆形成率為0％；通過XTT法繪制生長曲線時發(fā)現A2B5陽性細胞在無血清培養(yǎng)液下的生長速度較未分選細胞和A2B5陰性細胞快。體內成瘤實驗發(fā)現106個A2B5陽性細胞能在裸鼠皮下成瘤，H&E染色提示繼發(fā)腫瘤符合腦膠質瘤的典型組織學特性；A2B5陰性細胞多至10’級別亦不能在裸鼠皮下成瘤。免疫熒光染色發(fā)現無血清培養(yǎng)條件下的A285陽性細胞表達干細胞標記物Nestin和CD133；在含血清

8、分化培養(yǎng)條件下表達分化標記物GFAP、β-tubulin和CNPase。流式雙標染色結果表明：A2B5陽性細胞中含有CD133陽性細胞及CD133陰性細胞；而A2B5陰性細胞均為CD133陰性細胞，不存在A2B5-CD133+細胞，A2B5陽性細胞囊括了所有CD133陽性膠質瘤細胞。
　　通過對原代膠質母細胞瘤分選后得到的兩群細胞進行免疫熒光染色，我們發(fā)現：A2B5陽性細胞和A2B5陰性細胞均能表達負性共刺激分子B7-H1，并且A

9、2B5陽性細胞B7-H1的表達水平較A2B5陰性細胞高；對上述兩群細胞進行Western Blot法檢測B7-H1蛋白的結果表明：B7-H1蛋白在A2B5陽性膠質瘤干細胞樣細胞中的表達水平較A2B5陰性腫瘤細胞高；對上述兩群細胞進一步采用流式細胞術檢測B7-H1的表達量，結果提示：A2B5陽性細胞和A2B5陰性細胞均能表達負性共刺激分子B7-H1，但B7-H1在前者的表達水平高于后者(39.50％±8.76％Vs16.41％±5.41％

10、)。對長期體外培養(yǎng)的腦膠質瘤細胞系進行流式雙標法檢測結果提示：B7-H1在A2B5陽性細胞和A285陰性細胞中的表達率分別為31.22％±24.04％和42.52％±25.20％，兩者之間的差異未達到統計學顯著性。
　　通過腫瘤抗原致敏DCs體外細胞毒實驗(殺傷實驗)我們發(fā)現：BTSCs抗原致敏的效應細胞較非BTSCs抗原致敏的效應細胞對腫瘤細胞(不管是BTSCs還是非BTSCs)的殺傷活性高(19.09％±2.89％Vs12.6

11、9％±3.47％：30.05％±4.98％Vs23.09％±1.04％，P<0.05)；用同種抗原致敏的效應細胞(不管是用BTSCs抗原還是以非BTSCs抗原致敏)對于BTSCs的殺傷率低于對非BTSCs的殺傷率(19.09％±2.89％Vs30.05％±4.98％；12.69％±3..47％Vs23.09％±1.04％，P<0.01)；利用封閉抗體將B7-H1封閉后效應細胞對于BTSCs的殺傷率明顯增加(29.77％±3.05％Vs1

12、9.09％±2.89％，P<0.01)，平均增加率為55.95％，而效應細胞對于非BTSCs的殺傷率增加不顯著(33.71％±6.08％Vs30.05％±4.98％，P>0.05)，效應細胞對于BTSCs和非BTSCs的殺傷率無統計學差異(29.77％±3.05％Vs33.71％±6.08％，P>0.05)。
　　通過特異性T細胞增殖實驗我們發(fā)現：A2B5+BTSCs能顯著抑制自體T細胞的增殖，將B7-H1配體封閉后T細胞的增殖活

13、性部分恢復；A285細胞對自體T細胞的增殖活性抑制不明顯。
　　通過對在三種不同培養(yǎng)條件下的U87細胞進行殺傷實驗，按第1)、第2)、第3)組腫瘤細胞，未封閉B7-H1在前、封閉了B7-H1在后的順序，T細胞殺傷率依次為：24.56％、25.70％、17.00％、12.80％、24.30％和23.18％；通過統計分析，我們發(fā)現：將B7-H1封閉前后三組腫瘤細胞的平均被殺傷率分別為21.95％±4.29％和20.56％±6.84％，

14、兩者之間的差異未達到統計學顯著性。
　　[結論]
　　A285陽性膠質瘤細胞具有BTSCs特性，且A285陽性膠質瘤細胞囊括了所有CD133+BTSCs，表明A2B5能作為分選BTSCs的一種高效標記；A2B5+BTSCs能誘導產生免疫抑制，而A2B5非BTSCs不具有免疫抑制性；A2B5+BTSCs不僅在數量上較A2B5非BTSCs高表達負性共刺激分子B7-H1，且在功能上更利于通過B7-H1途徑實施免疫逃逸；將PD-1/