負(fù)性協(xié)同刺激分子B7-H1在人結(jié)直腸癌表達(dá)的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、機(jī)體在抗腫瘤、抗感染和自身免疫疾病時(shí)，主要通過(guò)活化的T淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用。T細(xì)胞的活化不僅需要TCR與抗原肽-MHC復(fù)合物作用產(chǎn)生的第一信號(hào)，還需要抗原提呈細(xì)胞(APC)表面B7家族協(xié)同刺激分子與T細(xì)胞上的相應(yīng)配體結(jié)合產(chǎn)生的第二信號(hào)。協(xié)同刺激分子與配體結(jié)合產(chǎn)生正性或負(fù)性信號(hào)，調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)。負(fù)性協(xié)同刺激分子B7-H1在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因PTEN通過(guò)

2、負(fù)性調(diào)控PI3K/Akt通路，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增值過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，PTEN分子表達(dá)缺失使得PI3K/Akt通路被激活，從而通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制上調(diào)B7-H1的表達(dá)。microRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過(guò)與靶mRNA的3'-UTR互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因翻譯，在基因表達(dá)中發(fā)揮著重要的作用。有些異常表達(dá)的miRNA參與了腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。
　　 本課題主要研究人

3、結(jié)直腸癌中異常表達(dá)的miRNA通過(guò)調(diào)控PTEN途徑對(duì)B7-H1分子表達(dá)的間接調(diào)控作用。
　　 第一部分人結(jié)直腸癌中miR-20b和miR-130b通過(guò)抑制PTEN途徑介導(dǎo)B7-H1分子上調(diào)表達(dá)的機(jī)制。
　　 [目的]探討miRNA通過(guò)調(diào)控PTEN途徑對(duì)B7-H1在結(jié)直腸癌表達(dá)的作用。
　　 [方法]首先采用免疫組化法測(cè)定101例結(jié)直腸癌中B7-H1和PTEN的表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)分析。然后，采用miRNA芯片技術(shù)

4、測(cè)定6例結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中miRNA的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)分析癌組織中異常表達(dá)的miRNA。在這些miRNA中，使用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)可能與PTEN基因3’-UTR作用的miRNA。最后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析這些miRNA對(duì)PTEN基因表達(dá)的調(diào)控作用。
　　 [結(jié)果](1) B7-H1在44.6％的結(jié)直腸癌組織中表達(dá)，并且與PTEN的表達(dá)水平顯著相關(guān)（P=0.002）;(2)結(jié)直腸癌組織中有30條miRNA表達(dá)明顯高于癌

5、旁組織，其中miR-20b、miR-130b、miR-18a和miR-181b可能與PTEN基因3’-UTR結(jié)合;(3)構(gòu)建了含PTEN基因3’-UTR的熒光素酶重組載體，通過(guò)酶切和基因測(cè)序的方法鑒定正確，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-20b和miR-130b可以通過(guò)與含PTEN基因3’-UTR的熒光素酶重組載體結(jié)合而抑制其活性。
　　 [結(jié)論]結(jié)直腸癌組織中，B7-H1表達(dá)升高，并與PTEN表達(dá)顯著相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-20b

6、和miR-130b與PTEN基因的3’-UTR結(jié)合后抑制其分子表達(dá)。提示這兩個(gè)miRNA通過(guò)抑制PTEN表達(dá)導(dǎo)致B7-H1分子在腫瘤組織中異常表達(dá)。
　　 第二部分人結(jié)直腸癌中B7-H1基因突變影響miR-570結(jié)合導(dǎo)致B7-H1分子的表達(dá)。
　　 [目的]研究人結(jié)直腸癌中B7-H1基因突變影響miRNA結(jié)合導(dǎo)致B7-H1分子異常表達(dá)的作用。
　　 [方法]采用DNA測(cè)序法測(cè)定結(jié)直腸癌組織中B7-H1基因3’-U

7、TR的變異;然后采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)可能與堿基變異位點(diǎn)結(jié)合的miRNA;最后，采用體外功能實(shí)驗(yàn)研究miRNA對(duì)B7-H1基因表達(dá)的抑制作用，以及基因突變對(duì)miRNA調(diào)控作用的影響。
　　 [結(jié)果](1) B7-H1基因3’-UTR在37.5％(6/16)的結(jié)直腸癌組織中存在一個(gè)G＞C點(diǎn)突變，該突變位于miR-570的結(jié)合靶點(diǎn)內(nèi);(2) miR-570能顯著抑制B7-H1+/SGC-7901人胃癌細(xì)胞和B7-H1+/CHO細(xì)胞膜

8、上B7-H1蛋白的表達(dá)，并能顯著抑制B7-H1/3'-UTR/pGL-3載體和含miR-570作用靶點(diǎn)序列的pGL-3載體表達(dá)的熒光素酶蛋白，同時(shí)anti-miR-570能明顯上調(diào)B7-H1+/SGC-7901細(xì)胞和B7-H1-/MDA-MB-435人乳腺癌細(xì)胞上B7-H1表達(dá);(3) miR-570對(duì)含C等位基因型B7-H1/3'-UTR/pGL-3載體表達(dá)的抑制作用明顯低于G等位基因型。
　　 [結(jié)論]B7-H1基因3’-U