共刺激分子B7-H1在膀胱癌免疫逃逸和免疫治療中的作用研究.pdf

1、在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，腫瘤細(xì)胞和機(jī)體的免疫系統(tǒng)相互影響，相互制約。腫瘤細(xì)胞可以通過多種途徑逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視作用而使自身得以繁衍和發(fā)展，即發(fā)生腫瘤的免疫逃逸現(xiàn)象。對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制的研究一直是攻克腫瘤道路上的一個(gè)熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　 T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要形式之一，腫瘤免疫應(yīng)答的產(chǎn)生需要免疫系統(tǒng)有效識(shí)別和提呈腫瘤抗原，并活化特異性T細(xì)胞從而產(chǎn)生免疫殺傷作用。而腫瘤細(xì)胞往往可以通過異常表達(dá)和（或）缺如某些免疫分

2、子，使特異性T細(xì)胞處于無反應(yīng)或免疫耐受狀態(tài)，甚至導(dǎo)致T細(xì)胞凋亡，從而逃避機(jī)體的免疫殺傷作用。B7-H1是一種最近新發(fā)現(xiàn)的抑制性共刺激分子，其與受體結(jié)合后可以提供抑制性信號(hào)從而誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，抑制T細(xì)胞的活化和增殖，是近年來發(fā)現(xiàn)與腫瘤免疫逃逸有關(guān)的重要分子之一。目前研究已發(fā)現(xiàn)B7-H1在人肺癌、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、胃癌、腎細(xì)胞癌等多種腫瘤組織表面都有大量表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。
　

3、　 膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其治療后的高復(fù)發(fā)率及其惡性進(jìn)展的生物學(xué)行為均提示在膀胱癌中還存在著某些機(jī)制使膀胱癌細(xì)胞能夠逃避機(jī)體免疫細(xì)胞的殺傷作用，逃避機(jī)體的抗腫瘤免疫而繼續(xù)生長。B7-H1因其在T細(xì)胞活化和腫瘤免疫逃逸中的重要作用，已成為目前國內(nèi)外腫瘤學(xué)研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一。但是B7-H1在膀胱癌中的表達(dá)情況如何，特別是B7-H1是否在膀胱癌免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮作用，以及干預(yù)B7-H1信號(hào)能否成為膀胱癌免疫治療的新策略，目前

4、國內(nèi)外研究較少，鮮有報(bào)道。
　　 因此，本研究旨在通過檢測B7-H1在膀胱癌中的表達(dá)情況，并在體外檢測B7-H1過表達(dá)對(duì)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxicity lymphocyte，CTL）抗膀胱癌免疫效應(yīng)的影響，進(jìn)而探討其在膀胱癌免疫逃逸中的作用。在此基礎(chǔ)上，通過B7-H1阻斷型抗體阻斷B7-H1的表達(dá)，檢測B7-H1阻斷對(duì)腫瘤特異性CTL及兩種新型過繼免疫細(xì)胞（CD3AK細(xì)胞和CD3/CD28共刺激活化T細(xì)胞

5、）抗膀胱癌免疫效應(yīng)的影響，進(jìn)而探討B(tài)7-H1阻斷在膀胱癌免疫治療中的作用，以期為膀胱癌的免疫治療提供新的策略。
　　 第一部分：膀胱癌組織中B7-H1的表達(dá)及其臨床意義
　　 目的：檢測B7-H1 mRNA及蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，并探討B(tài)7-H1的表達(dá)與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其臨床意義。
　　 方法：采用RT-PCR方法檢測B7-H1基因mRNA在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，采用免疫組化法檢測B7-H1蛋白及

6、FasL蛋白在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，并分析B7-H1的表達(dá)與膀胱癌各生物學(xué)指標(biāo)及FasL表達(dá)的相關(guān)性，同時(shí)隨訪膀胱癌患者術(shù)后生存情況，將B7-H1的表達(dá)與患者術(shù)后生存時(shí)間進(jìn)行生存分析。
　　 結(jié)果：B7-H1 mRNA和蛋白在正常膀胱組織中均無表達(dá)，而在膀胱癌組織中表達(dá)明顯增加，并且B7-H1的表達(dá)水平與膀胱癌的病理分級(jí)、臨床分期等生物學(xué)指標(biāo)密切相關(guān)。高分級(jí)組及浸潤型組B7-H1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平分別明顯高于低分級(jí)組和

7、淺表型組，復(fù)發(fā)組B7-H1蛋白的表達(dá)水平明顯高于初發(fā)組。同時(shí)，膀胱癌組織中B7-H1蛋白的表達(dá)與FasL蛋白的表達(dá)顯著相關(guān)。另外，B7-H1蛋白的表達(dá)與膀胱癌患者的預(yù)后具有明顯相關(guān)性，B7-H1陽性表達(dá)的患者其術(shù)后生存率明顯低于B7-H1陰性表達(dá)的患者，相關(guān)因素多變量分析發(fā)現(xiàn)B7-H1蛋白的表達(dá)可以作為膀胱癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)之一。
　　 結(jié)論：B7-H1在膀胱癌中存在著過表達(dá)，并且其表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可以作為評(píng)

8、價(jià)膀胱癌生物學(xué)行為的參考指標(biāo)。B7-H1與其受體結(jié)合后可能通過上調(diào)FasL的表達(dá)，觸發(fā)特異性T細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而介導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視作用。
　　 第二部分：膀胱癌細(xì)胞系BIU-87中B7-H1的表達(dá)及LPS對(duì)其表達(dá)的誘導(dǎo)作用
　　 目的：檢測B7-H1在膀胱癌細(xì)胞系BIU-87中的表達(dá)情況以及LPS對(duì)其表達(dá)的誘導(dǎo)作用，同時(shí)通過LPS誘導(dǎo)形成高表達(dá)B7-H1的BIU-87細(xì)胞，從而為下一步實(shí)驗(yàn)研究做準(zhǔn)備。

9、>　　 方法：采用RT-PCR方法和Western blot方法分別檢測B7-H1 mRNA和蛋白在BIU-87細(xì)胞中的表達(dá)情況，隨即給予不同濃度的LPS進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)而采用RT-PCR方法和Western blot方法分別檢測誘導(dǎo)后B7-H1 mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：體外常規(guī)培養(yǎng)未經(jīng)誘導(dǎo)的BIU-87細(xì)胞上有B7-H1 mRNA和蛋白的組成性表達(dá)，但表達(dá)量均較低。經(jīng)不同濃度LPS（0.5-2μg/mL）體外誘導(dǎo)

10、后，BIU-87細(xì)胞上B7-H1 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著增加，并且隨著LPS濃度的增加，B7-H1 mRNA和蛋白的表達(dá)量亦呈升高趨勢，其中當(dāng)LPS濃度為1μg/mL時(shí)，B7-H1 mRNA和蛋白的表達(dá)量到達(dá)高峰。
　　 結(jié)論：膀胱癌BIU-87細(xì)胞上有B7-H1 mRNA和蛋白的組成性表達(dá)，但表達(dá)量較低，經(jīng)LPS誘導(dǎo)后B7-H1 mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著增加。這表明可以通過LPS誘導(dǎo)形成高表達(dá)B7-H1的BIU-87細(xì)胞

11、，進(jìn)而模擬體內(nèi)B7-H1高表達(dá)的膀胱癌局部微環(huán)境。
　　 第三部分：B7-H1 參與膀胱癌細(xì)胞免疫逃逸的體外實(shí)驗(yàn)研究及其干預(yù)性治療
　　 目的：探討B(tài)7-H1在膀胱癌細(xì)胞免疫逃逸中的作用以及干預(yù)B7-H1信號(hào)對(duì)腫瘤抗原特異性CTL抗膀胱癌免疫效應(yīng)的影響。
　　 方法：利用LPS體外誘導(dǎo)形成高表達(dá)B7-H1的膀胱癌BIU-87細(xì)胞，以模擬膀胱癌患者體內(nèi)高表達(dá)B7-H1的腫瘤微環(huán)境。分離健康人外周血T細(xì)胞，以絲裂霉素

12、滅活的BIU-87細(xì)胞為刺激細(xì)胞，激活形成腫瘤抗原特異性CTL。將高表達(dá)B7-H1的BIU-87細(xì)胞及對(duì)照組BIU-87細(xì)胞與腫瘤抗原特異性CTL混合培養(yǎng)，MTT法檢測腫瘤抗原特異性CTL對(duì)BIU-87細(xì)胞的殺傷活性，PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤抗原特異性CTL自身的凋亡率。然后利用B7-H1單克隆抗體阻斷BIU-87細(xì)胞表面B7-H1的表達(dá)，MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測其對(duì)腫瘤抗原特異性CTL抗膀胱癌活性和自身凋亡率的影響。
　　

13、 結(jié)果：腫瘤抗原特異性CTL對(duì)高表達(dá)B7-H1的BIU-87細(xì)胞的殺傷活性與對(duì)照組相比明顯降低，而其自身的凋亡率卻明顯增加，體外存活時(shí)間亦明顯縮短。B7-H1表達(dá)被阻斷后，腫瘤抗原特異性CTL對(duì)BIU-87細(xì)胞的殺傷活性明顯增強(qiáng)，其自身凋亡率亦明顯降低，并且呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論：膀胱癌細(xì)胞可以通過表達(dá)B7-H1誘導(dǎo)腫瘤特異性CTL凋亡從而逃避腫瘤特異性CTL的殺傷作用，B7-H1可能在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展及免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮

14、重要的作用，干預(yù)B7-H1信號(hào)將有望成為膀胱癌免疫治療的新策略。
　　 第四部分：B7-H1 阻斷對(duì)CD3AK細(xì)胞及CD3/CD28 共刺激活化T細(xì)胞體外抗膀胱癌作用的影響
　　 目的：探討B(tài)7-H1阻斷對(duì)CD3AK細(xì)胞及CD3/CD28共刺激活化T細(xì)胞體外抗膀胱癌作用的影響。
　　 方法：分別利用CD3 mAb和CD3聯(lián)合CD28 mAb刺激健康人外周血淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生CD3AK細(xì)胞及CD3/CD28共刺激活化

15、T細(xì)胞。然后于培養(yǎng)體系中加入B7-H1阻斷型抗體阻斷B7-H1通路，3H-TdR滲入法檢測兩種免疫效應(yīng)細(xì)胞的體外增殖能力，ELISA法檢測其分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10的水平。最后，將兩種免疫效應(yīng)細(xì)胞分別作用于膀胱癌BIU-87細(xì)胞，MTT法檢測其對(duì)BIU-87細(xì)胞的體外殺傷活性。
　　 結(jié)果：B7-H1被阻斷后，CD3AK細(xì)胞及CD3/CD28共刺激活化T細(xì)胞的體外增殖能力明顯增強(qiáng)，存活時(shí)間明顯延長；并且其分泌IFN