膜引導(dǎo)結(jié)合Adv-BMP-2局部基因治療老年性骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 探討在老年骨再生功能低下時(shí)應(yīng)用膜引導(dǎo)結(jié)合Adv-BMP-2局部基因治療對(duì)骨缺損修復(fù)的促進(jìn)作用，以尋找治療老年性骨缺損的有效方法。 1.成骨細(xì)胞的提取、體外培養(yǎng)和鑒定；Adv-BMP-2的擴(kuò)增、純化、滴度測(cè)定；Adv-BMP-2對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 2.TNF-α對(duì)于成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和對(duì)BMP受體表達(dá)的調(diào)控作用。 3.手術(shù)建立大鼠去勢(shì)后骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動(dòng)物模型，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)

2、。 4.應(yīng)用體外法(ex vivo)進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)移,研究Adv-BMP-2對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠牙槽骨缺損修復(fù)的成骨效果。 5.異體冷凍骨膜與e-PTFE膜復(fù)合紅骨髓對(duì)頜骨缺損成骨性能的比較分析。 6.通過老年大鼠骨質(zhì)疏松骨缺損動(dòng)物模型,采用體內(nèi)法(in vivo)進(jìn)行BMP-2基因轉(zhuǎn)移結(jié)合膜引導(dǎo)修復(fù)老年性骨缺損并與其他不同植骨材料進(jìn)行比較，以尋找治療老年性骨缺損的有效方法。 方法： 1.成骨細(xì)胞

3、的提取、體外培養(yǎng)和鑒定。原代成骨細(xì)胞來(lái)自出生1周Wistar乳鼠，進(jìn)行成骨細(xì)胞培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察、ALP染色、體外礦化實(shí)驗(yàn)，鑒定成骨細(xì)胞是否培養(yǎng)成功。Adv-BMP-2的擴(kuò)增、純化、滴度測(cè)定。觀察成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染Adv-BMP-2后生物學(xué)行為的變化。 2.采用MTT及PNPP法檢測(cè)不同濃度TNF-α對(duì)于成骨細(xì)胞增殖和分化的影響。在保證細(xì)胞量相等的前提下，利用RT-PCR技術(shù)測(cè)定不同濃度TNF-α對(duì)于成骨細(xì)胞BMP受體表達(dá)的調(diào)控作用

4、。 3.建立大鼠骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動(dòng)物模型并通過各種檢測(cè)方法證實(shí)模型建立。40只3月齡雌性大鼠隨機(jī)分為4組，A組:SO組；B組：OVX組；C組：BD組；D組：OVX+BD組。術(shù)后8周、12周測(cè)定大鼠體重變化；血清中ALP、Ca、 P含量及子宮重量系數(shù)變化；用雙能X線吸收法(DEXA)行頜骨密度和骨礦含量測(cè)定。 4.20只健康雌性Wistar大鼠，隨機(jī)分為2組。實(shí)驗(yàn)組：A組為Adv-BMP-2轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞/CS組(A/C組)；對(duì)照

5、組：B組為去勢(shì)牙槽骨缺損對(duì)照組(OB組)。分別在第8周、第12周處死動(dòng)物，獲取標(biāo)本并行大體觀察、X線檢查、組織學(xué)檢查。 5.將健康Wistar大鼠斷頸法處死后取顱骨頂骨骨膜制備異體冷凍骨膜(variant deepfreeze periosteum，VDP)備用。24只成年Wistar大鼠隨機(jī)分為3組。于下頜骨升支部制造約0.5cm×0.5cm的骨缺損。A組：SO組：B組：e-PTFE/RBM組；C組:VDP/RBM組。分別在第

6、4周、第8周處死動(dòng)物，獲取標(biāo)本行大體觀察、x線檢查、組織學(xué)檢查。觀察不同膜引導(dǎo)成骨性能的效果。 6.40只雌性，老年Wistar大鼠22月齡(體重330+32g)，SPF級(jí)(無(wú)特定病原體動(dòng)物)，隨機(jī)將40只Wistar大鼠分為ABCDE五組： A組為SO組；B組為VDP/Adv-BMP-2/CS組；C組為VDP/Perioglas組；D組為VDP/HPPA組；E組為VDP/Adv-GFP/CS組。于下頜骨升支部制造約0.5cm

7、X 0.5cn的的全厚下頜骨缺損模型，BCD實(shí)驗(yàn)各組分別植入不同材料。A組為對(duì)照組未植入任何材料，作為空白對(duì)照。分別于術(shù)后第8周、第12周處死動(dòng)物。獲取標(biāo)本并行大體觀察、x線檢查、組織學(xué)檢查、免疫組化檢查。E組行體內(nèi)綠色熒光蛋白成骨示蹤，觀察各組不同時(shí)期的新生骨量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。 結(jié)論： 1.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)：Adv-BMP2對(duì)成骨細(xì)胞增殖功能和分化功能有明顯促進(jìn)作用。為后續(xù)BMP-2基因治療的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

8、 2.當(dāng)TNF-α濃度大于50ng/ml時(shí)對(duì)于成骨細(xì)胞增殖就有明顯的抑制作用。當(dāng)TNF-α的濃度大于5ng/ml時(shí)對(duì)于成骨細(xì)胞分化有明顯抑制作用。不同濃度TNF-α均可以抑制BMP-IA和B MlPR-II基因的表達(dá)，但對(duì)BMP-IB卻有促進(jìn)作用?？傮w說(shuō)來(lái)，TNF-α對(duì)于BMPR復(fù)合體起抑制作用。 3.可以手術(shù)制備大鼠骨質(zhì)疏松牙槽骨缺損動(dòng)物模型，為進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 4.體外法(ex vivo)進(jìn)行BMP-2基因