膜引導結合Adv-BMP-2局部基因治療老年性骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的： 探討在老年骨再生功能低下時應用膜引導結合Adv-BMP-2局部基因治療對骨缺損修復的促進作用，以尋找治療老年性骨缺損的有效方法。 1.成骨細胞的提取、體外培養(yǎng)和鑒定；Adv-BMP-2的擴增、純化、滴度測定；Adv-BMP-2對成骨細胞生物學行為的影響。 2.TNF-α對于成骨細胞生長的影響和對BMP受體表達的調控作用。 3.手術建立大鼠去勢后骨質疏松牙槽骨缺損動物模型，為進一步的動物實驗奠定基礎

2、。 4.應用體外法(ex vivo)進行BMP-2基因轉移,研究Adv-BMP-2對骨質疏松大鼠牙槽骨缺損修復的成骨效果。 5.異體冷凍骨膜與e-PTFE膜復合紅骨髓對頜骨缺損成骨性能的比較分析。 6.通過老年大鼠骨質疏松骨缺損動物模型,采用體內法(in vivo)進行BMP-2基因轉移結合膜引導修復老年性骨缺損并與其他不同植骨材料進行比較，以尋找治療老年性骨缺損的有效方法。 方法： 1.成骨細胞

3、的提取、體外培養(yǎng)和鑒定。原代成骨細胞來自出生1周Wistar乳鼠，進行成骨細胞培養(yǎng)，通過形態(tài)學觀察、ALP染色、體外礦化實驗，鑒定成骨細胞是否培養(yǎng)成功。Adv-BMP-2的擴增、純化、滴度測定。觀察成骨細胞轉染Adv-BMP-2后生物學行為的變化。 2.采用MTT及PNPP法檢測不同濃度TNF-α對于成骨細胞增殖和分化的影響。在保證細胞量相等的前提下，利用RT-PCR技術測定不同濃度TNF-α對于成骨細胞BMP受體表達的調控作用

4、。 3.建立大鼠骨質疏松牙槽骨缺損動物模型并通過各種檢測方法證實模型建立。40只3月齡雌性大鼠隨機分為4組，A組:SO組；B組：OVX組；C組：BD組；D組：OVX+BD組。術后8周、12周測定大鼠體重變化；血清中ALP、Ca、 P含量及子宮重量系數(shù)變化；用雙能X線吸收法(DEXA)行頜骨密度和骨礦含量測定。 4.20只健康雌性Wistar大鼠，隨機分為2組。實驗組：A組為Adv-BMP-2轉染成骨細胞/CS組(A/C組)；對照

5、組：B組為去勢牙槽骨缺損對照組(OB組)。分別在第8周、第12周處死動物，獲取標本并行大體觀察、X線檢查、組織學檢查。 5.將健康Wistar大鼠斷頸法處死后取顱骨頂骨骨膜制備異體冷凍骨膜(variant deepfreeze periosteum，VDP)備用。24只成年Wistar大鼠隨機分為3組。于下頜骨升支部制造約0.5cm×0.5cm的骨缺損。A組：SO組：B組：e-PTFE/RBM組；C組:VDP/RBM組。分別在第

6、4周、第8周處死動物，獲取標本行大體觀察、x線檢查、組織學檢查。觀察不同膜引導成骨性能的效果。 6.40只雌性，老年Wistar大鼠22月齡(體重330+32g)，SPF級(無特定病原體動物)，隨機將40只Wistar大鼠分為ABCDE五組： A組為SO組；B組為VDP/Adv-BMP-2/CS組；C組為VDP/Perioglas組；D組為VDP/HPPA組；E組為VDP/Adv-GFP/CS組。于下頜骨升支部制造約0.5cm

7、X 0.5cn的的全厚下頜骨缺損模型，BCD實驗各組分別植入不同材料。A組為對照組未植入任何材料，作為空白對照。分別于術后第8周、第12周處死動物。獲取標本并行大體觀察、x線檢查、組織學檢查、免疫組化檢查。E組行體內綠色熒光蛋白成骨示蹤，觀察各組不同時期的新生骨量并進行統(tǒng)計學比較。 結論： 1.體外實驗證實：Adv-BMP2對成骨細胞增殖功能和分化功能有明顯促進作用。為后續(xù)BMP-2基因治療的應用研究奠定了基礎。

8、 2.當TNF-α濃度大于50ng/ml時對于成骨細胞增殖就有明顯的抑制作用。當TNF-α的濃度大于5ng/ml時對于成骨細胞分化有明顯抑制作用。不同濃度TNF-α均可以抑制BMP-IA和B MlPR-II基因的表達，但對BMP-IB卻有促進作用?？傮w說來，TNF-α對于BMPR復合體起抑制作用。 3.可以手術制備大鼠骨質疏松牙槽骨缺損動物模型，為進一步的動物實驗奠定基礎。 4.體外法(ex vivo)進行BMP-2基因