Ad-BMP2基因轉(zhuǎn)染肌衛(wèi)星細胞成骨誘導及骨缺損修復實驗研究.pdf

1、目的： 1．探討GFP轉(zhuǎn)基因鼠咀嚼肌肌衛(wèi)星細胞的分離，鑒定及體外培養(yǎng)方法，研究其生物學特性及體外細胞培養(yǎng)傳代對咀嚼肌衛(wèi)星細胞GFP熒光保持的影響，從而探討GFP轉(zhuǎn)基因鼠咀嚼肌衛(wèi)星細胞移植入野生型小鼠后是否可以作為追蹤細胞轉(zhuǎn)歸的有效方法。 2．研究腺病毒介導的BMP-2基因轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌衛(wèi)星細胞(SMSCs)后經(jīng)體外誘導轉(zhuǎn)化為成骨樣細胞的能力，探討骨骼肌衛(wèi)星細胞作為骨組織工程種子細胞的可能性。 3．觀察腺

2、病毒介導的BMP-2基因轉(zhuǎn)染GFP轉(zhuǎn)基因鼠肌衛(wèi)星細胞后體內(nèi)骨誘導能力及骨缺損修復能力。 方法： 1．取10只新生三日齡綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠面部咀嚼肌，采用酶消化法分離出咀嚼肌肌衛(wèi)星細胞，體外進行原代和傳代培養(yǎng)，建立了一個GFP轉(zhuǎn)基因小鼠肌衛(wèi)星細胞系。通過倒置顯微鏡觀察肌衛(wèi)星細胞的形態(tài)、生長曲線測定等指標來研究咀嚼肌肌衛(wèi)星細胞的增殖與分化能力，通過熒光顯微鏡觀察GFP熒光的保持及表達。MTT法對不同濃度的FBS

3、，不同接種密度及不同濃度的IGF-1對肌衛(wèi)星細胞生長增值中的作用進行測定。利用免疫細胞化學染色對所獲得的細胞進行骨骼肌肌動蛋白，結(jié)蛋白鑒定，DAPI進行細胞核的標記檢測培養(yǎng)細胞的純度。 2．將分離出的SMSCs，進行體外原代及傳代培養(yǎng)后，經(jīng)腺病毒介導的人骨形成蛋白2(Ad-BMP2)轉(zhuǎn)染，通過倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后肌衛(wèi)星細胞的形態(tài)，應用改良Gomori氏鈣鈷法顯示堿性磷酸酶的ALP活性(組織化學染色方法)及生物化學方法進行定量檢測

4、、免疫細胞化學染色進行骨鈣素及I型膠原的檢測，ELISA方法進行骨鈣素含量測定，western blot方法進行轉(zhuǎn)染細胞的BMP-2蛋白表達檢測并進行體外礦化能力的測定。 3．將轉(zhuǎn)染BMP-2基因的肌衛(wèi)星細胞吸收到膠原支架上，進行動物體內(nèi)實驗觀察異位骨誘導能力及骨缺損修復能力。129sv小鼠45只，,體重24-30g，年齡6-8周。其中 15R 129sv小鼠隨機分成3組，每組5只，麻醉后將細胞膠原支架復合物移植入野生型svl

5、29小鼠的后小腿肌肉中，術(shù)后2、3及4周取出標本，進行X線片觀察，組織學觀察及熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞的誘導成骨能力；別外30只 129sv小鼠隨機分成對照組與實驗組2大組，每大組15只，每大組又分成3小組，每小組5只。麻醉后在野生型129 sv小鼠顱頂骨上制作5mm的骨缺陷，將細胞膠原支架復合物移植入野生型129sv小鼠顱頂骨缺陷中，術(shù)后2、3及4周各組處死5只取出標本，進行軟X線觀察及激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞對骨缺陷的修復能力。