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文檔簡介
1、研究目的:
1.探討從兔下頜骨骨膜和骨髓分離的兩種不同來源的間充質(zhì)細(xì)胞在體外的生長特點和生物學(xué)功能的差異,為基因工程和組織工程篩選合適的種子細(xì)胞,為后續(xù)的實驗研究奠定基礎(chǔ)。
2.探討腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Ad-BMP-2)基因轉(zhuǎn)染對體外培養(yǎng)的骨膜細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖以及向成骨細(xì)胞系分化的作用,觀察目的基因在兩種細(xì)胞內(nèi)的表達情況,從而為基因治療選擇合適的靶細(xì)胞。
3.探討腺病毒介導(dǎo)的骨
2、形態(tài)發(fā)生蛋白2(Ad-BMP-2)誘導(dǎo)兔下頜升支外側(cè)骨膜異位成骨的作用機制。
4.探討多孔狀生物活性玻璃陶瓷(BGC)與體外培養(yǎng)擴增的兔骨膜細(xì)胞的生物相容性,為骨組織工程載體材料的選擇提供依據(jù)。
5.探討腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Ad-BMP-2)基因修飾的骨膜細(xì)胞與生物活性玻璃陶瓷復(fù)合修復(fù)兔下頜骨臨界骨缺損的能力,并對基因修飾的組織工程化骨的作用機制進行初步探討。
研究方法:
3、 1.通過酶消化法分離培養(yǎng)骨膜細(xì)胞,密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞,體外對兩種細(xì)胞分別進行培養(yǎng)擴增。在體外對兩種細(xì)胞進行形態(tài)學(xué)觀察、增殖能力測定、克隆形成能力測定、ALP定性定量檢測以及體外礦化能力的檢測;在體內(nèi),將兩種細(xì)胞接種到自體背部肌袋內(nèi),6周后觀察異位骨形成效果。
2.利用人胚腎293細(xì)胞擴增腺病毒,空斑形成試驗檢測病毒滴度;將Ad-BMP-2轉(zhuǎn)染骨膜細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞,原位雜交試驗測定目的基因的表達,酶聯(lián)免疫吸附
4、試驗(ELISA)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的蛋白的表達,噻唑藍比色法(MTT法)測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖能力,酶動力學(xué)法測定堿性磷酸酶(ALP)活性,并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。
3.18只成年新西蘭大白兔按隨機化原則分成3組,每組6只,在一側(cè)下頜升支外側(cè)骨膜處注射0.2ml Ad-BMP-2(共含病毒滴度2×109pfu)作為實驗組,對側(cè)注射等量的PBS作為對照組,術(shù)后2、5、10周分別處死1組動物,行大體觀察、影像學(xué)和組織學(xué)檢查,觀察新骨
5、形成的時間和空間變化特點。
4.體外培養(yǎng)并擴增兔骨膜細(xì)胞,運用MTT法和酶學(xué)測定法分別檢測BGC提取液對細(xì)胞增殖和堿性磷酸酶(ALP)活性的影響,運用倒置相差顯微鏡、掃描電鏡觀察與BGC復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞在材料內(nèi)的生長情況。
5.將18只新西蘭大白兔按隨機化原則分成甲、乙兩組,每組9只,在每只兔雙側(cè)下頜骨體部制作10mm×6mm的矩形骨缺損,按植入物的不同分為4小組。A組:植入Ad-BMP-2基因修飾的組織工程化
6、骨(甲組右側(cè));B組:植入未經(jīng)基因修飾的組織工程化骨(甲組左側(cè));C組:植入單純BGC材料(乙組右側(cè));D組:空白對照組(乙組左側(cè)),保留缺損,未植入任何材料。術(shù)后4、8、12周分別處死甲、乙兩組3只動物,行大體觀察、影像學(xué)和組織學(xué)檢查,對各個時期的新骨形成的數(shù)量進行定量分析,并對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。
結(jié)果:
1.兩種不同來源的間充質(zhì)細(xì)胞在體外均表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞樣的外觀。在同等條件下,骨膜細(xì)胞的增殖能力要高于
7、骨髓基質(zhì)細(xì)胞,但克隆形成率低于后者;骨膜細(xì)胞表達較高的ALP活性,骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達較低的ALP活性,前者是后者的3~4倍;在誘導(dǎo)培養(yǎng)液存在的條件下,在體外均能形成礦化結(jié)節(jié),植入體內(nèi)6周后均能分化形成骨樣組織,前者以骨膜化骨為主,后者以軟骨化骨為主。
2.我們擴增的病毒滴度為5.5×1010pfu/ml;兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率與病毒濃度有關(guān),在感染復(fù)數(shù)為100時,轉(zhuǎn)染率均達95%以上;轉(zhuǎn)染第1d時即有目的蛋白的表達,在第5d時達
8、到高峰,分別為3126.3±150.5 pg/ml和3069.7±159 pg/ml,在體外功能蛋白的表達至少持續(xù)2周;基因轉(zhuǎn)染對細(xì)胞的增殖能力影響不大,甚至可以促進細(xì)胞的增殖;兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌ALP的能力均明顯提高,這種作用與病毒濃度成正相關(guān)關(guān)系,基因轉(zhuǎn)染對骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌ALP能力的影響高于對骨膜細(xì)胞的影響。
3.Ad-BMP-2局部注射可以引起一定程度的炎癥反應(yīng),這種反應(yīng)隨時間延長逐漸減弱;第2周時,注射區(qū)域的細(xì)胞開
9、始增殖和分化,有較多成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞聚集;第5周時,類骨基質(zhì)開始形成,部分區(qū)域開始礦化;第10周時,有編織骨和髓腔樣結(jié)構(gòu)形成。骨化程度在不同個體間存在差異,骨化方式早期包括軟骨化骨和膜性化骨兩種方式,晚期以膜性化骨為主。而注射PBS側(cè)始終沒有新骨形成。
4.BGC提取液對培養(yǎng)早期細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用,對培養(yǎng)晚期細(xì)胞的增殖無明顯影響,在細(xì)胞培養(yǎng)過程中能上調(diào)骨膜細(xì)胞分泌ALP的能力;細(xì)胞在BGC材料孔隙表面生長增殖良好,
10、并能分泌細(xì)胞外基質(zhì)。
5.術(shù)后各組動物均生長良好,各實驗組均未出現(xiàn)急性免疫排斥反應(yīng)。影像學(xué)顯示:第4周,A、B、C三個實驗組的移植材料與周圍骨組織均開始融合,邊界模糊。第8周,A組植入材料密度與周圍骨組織相近,交界線基本消失,B、C組密度略低。第12周,各實驗組與周圍骨組織完全融合,但材料密度仍以A組高。對照組始終存在骨缺損。組織學(xué)檢查結(jié)果:從第4周開始,A、B、C三組材料周邊空隙內(nèi)均有較多的新骨形成,隨移植時間延長,新骨
11、量增多,礦化程度增高,在各個時間點,A組形成的新骨均高于B組(P<0.05)和C組(P<0.01);而材料內(nèi)部,A、B兩組均有新生骨組織形成,新生骨量相似(P>0.05),明顯高于C組(P<0.05)。對于D組,缺損周邊有少量的新骨形成,大部分區(qū)域為纖維結(jié)締組織,12周時仍遺留明顯骨性缺損。
結(jié)論:
1.兩種不同來源的間充質(zhì)細(xì)胞具有相似的細(xì)胞形態(tài),但生物學(xué)功能存在差異,在適宜的刺激因素下均能向成骨細(xì)胞系分化,
12、提示下頜骨骨膜細(xì)胞也可以作為組織工程的良好的種子細(xì)胞來源之一。
2.兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞均可以高效的表達目的基因和目的蛋白,Ad-BMP-2基因轉(zhuǎn)染可以促進細(xì)胞向成骨細(xì)胞系的分化,骨膜細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞均可以作為腺病毒載體轉(zhuǎn)染的良好的靶細(xì)胞。
3.一定濃度的Ad-BMP-2可以誘導(dǎo)下頜升支外側(cè)骨膜和肌肉內(nèi)的異位骨形成,增加皮質(zhì)骨的厚度。
4.在體外多孔狀BGC具有良好的細(xì)胞相容性,可以作為細(xì)胞載體應(yīng)用于
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