小麥染色體BAC文庫構(gòu)建技術(shù)優(yōu)化及小麥抗逆相關(guān)基因分子鑒定.pdf

1、細(xì)菌人工染色體文庫 (bacterial artificial chromosome，BAC) 在基因組物理圖譜構(gòu)建、基因組測序、基因圖位克隆以及基因結(jié)構(gòu)和調(diào)控研究等方面發(fā)揮了巨大作用。本研究以普通小麥中國春端體5DL 為材料，通過對染色體流式分選技術(shù)、從分選染色體中獲取高分子量 (high molecular weight，HMW) DNA及雙元細(xì)菌人工染色體文庫 (binary BAC，BIBAC) 構(gòu)建技術(shù)優(yōu)化，以完善小麥染色體特

2、異文庫構(gòu)建技術(shù)體系。取得以下研究結(jié)果： 1、普通小麥中國春端體5DL 根尖細(xì)胞周期同步化：經(jīng)1.25 mM 羥基脲 (hydroxyurea，HU) 處理18 h，隨之進(jìn)行6 h的恢復(fù)處理可將85﹪以上的細(xì)胞同步化，隨后再經(jīng)1μM氟樂靈(trifluralin)處理2.5 h，60﹪以上細(xì)胞被阻斷在中期。 2、高質(zhì)量染色體懸液制備結(jié)果：同步化的根尖細(xì)胞經(jīng)2﹪多聚甲醛固定20 min，機(jī)械勻漿釋放染色體并結(jié)合10﹪及30﹪

3、蔗糖濃度梯度純化釋放的染色體懸液。利用該方法可獲得染色體結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞碎片含量少、背景清晰的染色體懸浮液，適合于流式核型分析。 3、普通小麥中國春端體5DL 的流式核型分析：結(jié)果表明普通小麥中國春端體 5DL 的流式核型除具有普通小麥的4個(gè)峰外(復(fù)合峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及染色體3B)，還存在一個(gè)額外峰。 4、染色體5DL 分選及鑒定：將中國春端體5DL流式核型圖中額外峰染色體分選，采用特異的微衛(wèi)星引物Xgwm174進(jìn)行PCR，結(jié)

4、果可得到一條233 bp的特異條帶，同時(shí)結(jié)合對分選來自額外峰染色體鏡檢觀察，表明分選的染色體正是端體5DL。 5、從分選染色體中獲取HMW DNA：對復(fù)合峰染色體設(shè)門分選，并經(jīng)2 U BamHI酶切3-10 min，可得絕大部分為50-300 kb的HMW DNA。 6、BIBAC載體容載能力檢測：隨機(jī)抽提50個(gè)克隆進(jìn)行 NotⅠ完全酶切，插入片斷大小可達(dá)100kb左右。 通過上述技術(shù)優(yōu)化，初步建立了適合進(jìn)行小麥

5、染色體特異文庫構(gòu)建的技術(shù)體系。 干旱、高鹽及低溫是影響作物生長的三種主要非生物脅迫因子。Na<'+>液泡內(nèi)區(qū)域化是植物特別是鹽生植物適應(yīng)Na<'+>毒害非常有效的手段，液泡型Na<'+>/H<'+>逆轉(zhuǎn)蛋白在這一過程中起重要的作用。本研究對Na<'+>/H<'+>逆轉(zhuǎn)蛋白及與逆境脅迫相關(guān)的激酶CDPKs、MAPKs的相關(guān)分子生物學(xué)功能進(jìn)行鑒定，結(jié)果如下： 1、小麥Na<'+>/H<'+>逆轉(zhuǎn)蛋白基因表達(dá)特性分析：根據(jù) N

6、a<'+>/H<'+>逆轉(zhuǎn)蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行半定量RT-PCR，結(jié)果表明小麥 Na<'+>/H<'+>轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物體內(nèi)表達(dá)量與干旱、高鹽及低溫脅迫有關(guān)，而與ABA無關(guān)。 2、小麥Na<'+>/H<'+>逆轉(zhuǎn)蛋白生物信息學(xué)分析：運(yùn)用DNAMAN軟件對小麥Na<'+>/H<'+>逆轉(zhuǎn)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析表明其存在11個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。 3、小麥Na<'+>/H<'+>逆轉(zhuǎn)蛋白亞細(xì)胞定位分析：借助高效表達(dá)的綠色熒光蛋白(gr

7、een fluorescenceprotein，GFP)載體16318GFP，將Na<'+>/H<'+>轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因與之融合，通過微粒轟擊進(jìn)行Na<'+>H<'+>逆轉(zhuǎn)蛋白亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明Na<'+>/H<'+>逆轉(zhuǎn)蛋白主要定位在液泡膜上。 4、依賴于鈣離子的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases，CDPKs)CDPKI、CDPK2表達(dá)特性分析：采用半定量RT-PCR法進(jìn)行CDPK1

8、、CDPK2表達(dá)特性分析，結(jié)果表明CDPK1、CDPK2與干旱、高鹽、低溫及ABA誘導(dǎo)皆有關(guān)。 5、CDPK1及分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)原核誘導(dǎo)表達(dá)：將CDPK1及．MAPKs基因全長構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1，誘導(dǎo)其在原核宿主菌內(nèi)表達(dá)，結(jié)果表明：隨著IPTG誘導(dǎo)時(shí)間的延長其表達(dá)量逐漸增加。CDPK1、MAPK1及MAPK2三種激酶的成功誘導(dǎo)