豁眼鵝細(xì)菌人工染色體文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量鑒定.pdf

1、目的：
　　 以豁眼鵝為試驗(yàn)材料，構(gòu)建豁眼鵝細(xì)菌人工染色體文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量鑒定，為永久保存和利用其遺傳資源、開(kāi)展與其重要經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的功能基因篩選研究提供試驗(yàn)材料和技術(shù)保證。
　　 方法：
　　 采集豁眼鵝翅靜脈血，利用瓊脂糖包埋法獲得高分子質(zhì)量（HMW）DNA；通過(guò)Hind Ⅲ、EcoRI和BamH I 3 種限制性?xún)?nèi)切酶酶切濃度梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)，得到最佳酶切反應(yīng)條件，并進(jìn)行二次脈沖電泳分離并回收100 kb～

2、500 kb的DNA 片段；利用電洗脫方法將DNA 片段從瓊脂糖凝膠塊上洗脫下來(lái)，并使用PEG8000 對(duì)其進(jìn)行濃縮和純化處理；以pBeloBAC11 為載體，進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞；利用藍(lán)白斑篩選挑取和保存陽(yáng)性單克??；對(duì)保存的文庫(kù)進(jìn)行插入片段大小、克隆穩(wěn)定性和基因組覆蓋率等方面的質(zhì)量鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 酶切濃度梯度試驗(yàn)表明，Hind Ⅲ為最佳限制性?xún)?nèi)切酶，且最佳酶用量為40 U/μL Hin

3、d Ⅲ。
　　 本研究共挑取了115，200個(gè)克隆，隨機(jī)挑選了100個(gè)BAC 克隆，對(duì)其外源插入片段大小的分析表明，外源插入片段在40 kb～200 kb之間，平均大小為102 kb，空克隆的比例為0.6％，基因組覆蓋率為11.4 倍。將BAC 克隆保存于300 塊384 孔板中。挑選5個(gè)較大片段的BAC 克隆，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)5天，每天代表20 代，分別提取第一天和第五天的質(zhì)粒DNA，進(jìn)行Hind Ⅲ酶切及瓊脂糖凝膠電泳分析以確定

4、文庫(kù)的穩(wěn)定性，結(jié)果表明帶型無(wú)明顯差異，說(shuō)明BAC 克隆在連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)過(guò)程中十分穩(wěn)定。
　　 結(jié)論：
　　 本研究成功構(gòu)建了含115，200個(gè)克隆的豁眼鵝細(xì)菌人工染色體文庫(kù)。該文庫(kù)具有外源插入片段大、基因組覆蓋率高、空載率低等特點(diǎn)。
　　 對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量檢測(cè)證實(shí)所構(gòu)建的文庫(kù)可滿(mǎn)足相關(guān)試驗(yàn)的需要；BAC 克隆經(jīng)繼代培養(yǎng)說(shuō)明所得到的豁眼鵝BAC系統(tǒng)十分穩(wěn)定。本研究構(gòu)建的豁眼鵝細(xì)菌人工染色體文庫(kù)適用于功能基因克隆和物理圖譜