4-羥基苯基維甲酰胺抗肝癌作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肝癌是一種嚴(yán)重威脅人類生命的惡性腫瘤，臨床死亡率極高。早期肝癌病人通常采用外科手術(shù)或肝移植來治療。目前，70％的病人由于肝臟腫瘤的快速生長以及肝臟狀況的不斷惡化而不易進(jìn)行手術(shù)治療，而且肝癌屬于一種對(duì)全身性化療有抗性作用的腫瘤，因此尋找新的抗肝癌化療藥物或新的治療方案成為全世界腫瘤研究者的關(guān)注熱點(diǎn)。 4-羥基苯基維甲酰胺(N-(hydroxyphenyl)retinamide，4-HPR，F(xiàn)enretinide)是19世紀(jì)70年代

2、人工合成的維甲酸類化合物，與傳統(tǒng)維甲酸類化合物相似，可有效用于多種腫瘤的化學(xué)預(yù)防。此外，4-HPR由于其獨(dú)特的組織分布、誘導(dǎo)凋亡活性及較小的毒性有別于傳統(tǒng)維甲酸類化合物，可用于多種腫瘤的化學(xué)治療。近年來國外使用4-HPR合用其它類化療藥物的一些臨床試驗(yàn)研究表明4-HPR可明顯協(xié)同其它類化療藥物的抗癌作用，同時(shí)副作用較少，可長期服用，是一種非常有潛力的抗腫瘤藥物。4-HPR的確切抗腫瘤機(jī)制尚未完全闡明，研究證實(shí)，4-HPR的體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋

3、亡途徑可能是多通路的，包括維甲酸(RA)受體依賴性通道，活性氧簇的大量產(chǎn)生以及神經(jīng)酰胺通路的激活等等。本文旨在研究4-HPR對(duì)人肝癌細(xì)胞株的體內(nèi)外抑制效應(yīng)，并探討其可能的作用機(jī)制，為拓展其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 目的：研究4-HPR在體內(nèi)外的抗肝癌作用，并探討其作用機(jī)制。 方法：分別采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)4-HPR體外抑制肝癌細(xì)胞活性及量效關(guān)系；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測4-HPR誘導(dǎo)Bel7402細(xì)胞發(fā)生凋亡的時(shí)效關(guān)系；采用

4、裸小鼠皮下種植模型，觀察4-HPR對(duì)荷人肝癌Bel7402裸小鼠的整體實(shí)驗(yàn)治療作用；采用Westernblotting方法檢測4-HPR對(duì)Bel7402細(xì)胞p53，Bcl-2，Bax，Pro-caspase，XIAP，PARP等蛋白表達(dá)水平；采用JC1和DCFDA染料法研究4-HPR對(duì)Bel7402細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體膜電位的影響；采用HPLC-MS/MS觀察4-HPR對(duì)Bel7402細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量的影響；采用抗氧化劑Piceata

5、nnol和Pan-Caspase抑制劑Boc-d-fmk研究4-HPR的作用環(huán)節(jié)，探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活、凋亡、神經(jīng)酰胺的合成和PARP表達(dá)水平等影響作用，進(jìn)一步確定4-HPR抑制肝癌細(xì)胞生長的分子作用機(jī)制。 結(jié)果：1、4-HPR對(duì)3種人肝癌細(xì)胞株的體外抑制作用：將細(xì)胞與藥物共同孵育72小時(shí)后，用MTT法測得4-HPR對(duì)人肝癌Bel-7402、Smmc-7721和HepG-2細(xì)胞的IC50值分別為12.7μM、12.5μM和13

6、.9μM。 2、4-HPR誘導(dǎo)人肝癌Bel-7402細(xì)胞凋亡作用：用15.0μM的4-HPR分別處理Bel-7402細(xì)胞12h，24h和48h，并設(shè)溶劑對(duì)照，收集各組細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，溶劑對(duì)照組的自發(fā)凋亡率為3％，隨著4-HPR作用時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率分別為7％(12h)、24％(24h)和40％(48h)。 3、4-HPR對(duì)人肝癌Bel-7402細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)治療作用：4-HPR對(duì)裸小鼠體內(nèi)B

7、el-7402腫瘤細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。在給藥過程中4-HPR25、50和100mg/kg組的裸小鼠體重基本不變，但給藥21天后抑瘤率分別達(dá)到38.9％、45.8％和58.3％。 4、4-HPR對(duì)Bel-7402細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響：用15.0μM4-HPR分別處理Bel-7402細(xì)胞12，24和48h，并設(shè)對(duì)照，收集各組細(xì)胞，提取蛋白，用Western印跡法檢測p53、Bcl-2、Bax、Pro

8、caspase-3和PARP蛋白表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示，隨給藥時(shí)間的延長，Bel-7402細(xì)胞的p53表達(dá)顯著增加，Bcl-2和Bax表達(dá)量的比值顯著下降，在給藥48h后Procaspase-3蛋白和XIAP的表達(dá)量降低減少，而PARP出現(xiàn)活性裂解片段。 5、Piceatannol對(duì)4-HPR誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響：2μg/mlPiceatannol可降低4-HPR誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺和ROS含量，抑制4-HPR誘

9、導(dǎo)肝癌細(xì)胞線粒體膜電位的下降，抑制4-HPR引起的PARP的裂解，從而抑制4-HPR誘導(dǎo)的Bel-7402細(xì)胞凋亡，增加肝癌細(xì)胞的存活率。 6、Boc-d-fmk對(duì)4-HPR誘導(dǎo)Bel-7402細(xì)胞凋亡的影響：40μMBoc-d-fmk可抑制4-HPR引起的PARP的裂解，從而抑制4-HPR誘導(dǎo)的Bel-7402細(xì)胞凋亡。 討論和結(jié)論：1、我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)4-HPR對(duì)人肝癌細(xì)胞離體和在體均有抑制作用，并進(jìn)一步證實(shí)其抗肝癌作

10、用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的。 2、野生型p53是一種強(qiáng)有力的腫瘤抑制基因，它可以通過多種途徑參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，如下調(diào)Bcl-2基因，上調(diào)Bax等基因促進(jìn)凋亡，通過死亡信號(hào)受體蛋白途徑誘導(dǎo)凋亡，還可直接刺激線粒體釋放活性氧而引發(fā)凋亡。當(dāng)p53接受信號(hào)刺激后，可激活Bax基因，使Bax和Bcl-2量的表達(dá)失去平衡，從而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究表明，在4-HPR作用48h后，細(xì)胞內(nèi)p53和Bax蛋白的表達(dá)明顯增高，Bcl-2蛋白的表達(dá)有

11、所降低，且Bcl-2與Bax的蛋白表達(dá)量比例顯著下降。該結(jié)果提示由4-HPR引起B(yǎng)el-7402細(xì)胞的凋亡與p53相關(guān)。 3、Caspase是在細(xì)胞凋亡中起作用的一組同源性蛋白，Caspase-3的活化在細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起核心作用，是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白激酶和主要效應(yīng)因子。大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素，均需通過Caspase-3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。做為Caspase-3的作用底物，PARP活性片斷的出現(xiàn)是Caspase途徑

12、被激活的重要證據(jù)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用4-HPR處理過的Bel-7402細(xì)胞中Caspase-3的表達(dá)量明顯升高，并在48小時(shí)處出現(xiàn)PARP的活性裂解片斷。同時(shí)凋亡抑制蛋白家族成員XIAP的表達(dá)量也有顯著的下調(diào)，而XIAP可以抑制Caspase-3的激活。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Caspase抑制劑Boc-d-fmk可抑制4-HPR引起的PARP的裂解，從而抑制4-HPR誘導(dǎo)的Bel-7402細(xì)胞凋亡。因此我們認(rèn)為，Caspase家族的激活是4

13、-HPR誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。 4、Piceatannol具有抗氧化作用，可抑制ROS產(chǎn)生。我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Piceatannol可降低4-HPR誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)酰胺和ROS含量，抑制4-HPR誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞線粒體膜電位的下降，抑制4-HPR引起的PARP的裂解，從而抑制4-HPR誘導(dǎo)的Bel-7402細(xì)胞凋亡，增加肝癌細(xì)胞的存活率。因此，促進(jìn)線粒體相關(guān)ROS含量途徑也是4-HPR誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制之一。